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May 14, 2024

Lipoproteine ​​der Liquor cerebrospinalis hemmen α

Molecular Neurodegeneration Band 18, Artikelnummer: 20 (2023) Diesen Artikel zitieren 1885 Zugriffe 3 Zitate 21 Altmetric Metrics Details Die Aggregation von α-Synuclein (α-syn) ist ein herausragendes Merkmal von

Molecular Neurodegeneration Band 18, Artikelnummer: 20 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Aggregation von α-Synuclein (α-syn) ist ein herausragendes Merkmal der Parkinson-Krankheit (PD) und anderer Synucleinopathien. Derzeit stellen α-syn-Seed-Amplifikationstests (SAAs) unter Verwendung von Liquor cerebrospinalis (CSF) die vielversprechendsten diagnostischen Instrumente für Synukleinopathien dar. Allerdings enthält CSF selbst mehrere Verbindungen, die die Aggregation von α-syn auf patientenabhängige Weise modulieren können, was möglicherweise nicht optimierte α-syn-SAAs untergräbt und die Samenquantifizierung verhindert.

In dieser Studie haben wir die hemmende Wirkung des CSF-Milieu auf den Nachweis von α-syn-Aggregaten mithilfe von CSF-Fraktionierung, Massenspektrometrie, Immunoassays, Transmissionselektronenmikroskopie, Kernspinresonanzspektroskopie in Lösung, einem hochpräzisen und standardisierten diagnostischen SAA und anderen charakterisiert In-vitro-Aggregationsbedingungen zur Bewertung der spontanen Aggregation von α-syn.

Wir fanden heraus, dass der hochmolekulare Anteil von CSF (> 100.000 Da) die α-syn-Aggregation stark hemmt, und identifizierten Lipoproteine ​​als Haupttreiber dieses Effekts. Eine direkte Wechselwirkung zwischen Lipoproteinen und monomerem α-syn wurde durch Kernspinresonanzspektroskopie in Lösung nicht nachgewiesen, dagegen beobachteten wir Lipoprotein-α-syn-Komplexe durch Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Beobachtungen sind mit der Hypothese einer Wechselwirkung zwischen Lipoproteinen und oligomeren/protofibrillären α-syn-Zwischenprodukten vereinbar. Wir beobachteten eine deutlich langsamere Amplifikation von α-syn-Samen im PD-CSF, wenn Lipoproteine ​​zum Reaktionsgemisch der diagnostischen SAA hinzugefügt wurden. Darüber hinaus beobachteten wir eine verringerte Hemmkapazität von CSF auf die α-syn-Aggregation nach Immundepletion von ApoA1 und ApoE. Schließlich beobachteten wir, dass die CSF-ApoA1- und ApoE-Spiegel signifikant mit den kinetischen SAA-Parametern in n = 31 SAA-negativen Kontroll-CSF-Proben korrelierten, die mit vorgebildeten α-syn-Aggregaten versetzt waren.

Unsere Ergebnisse beschreiben eine neuartige Wechselwirkung zwischen Lipoproteinen und α-syn-Aggregaten, die die Bildung von α-syn-Fibrillen hemmt und relevante Auswirkungen haben könnte. Tatsächlich erklärt die spenderspezifische Hemmung von CSF auf die α-syn-Aggregation das Fehlen quantitativer Ergebnisse aus der Analyse von SAA-abgeleiteten kinetischen Parametern. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass Lipoproteine ​​die wichtigsten hemmenden Komponenten von CSF sind, was darauf hindeutet, dass Messungen der Lipoproteinkonzentration in Datenanalysemodelle integriert werden könnten, um die störenden Auswirkungen des CSF-Milieu auf die Quantifizierungsbemühungen von α-syn zu eliminieren.

Parkinson-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körperchen (DLB) und Multisystematrophie (MSA) sind neurodegenerative Erkrankungen, die pathologisch durch das Vorhandensein intrazellulärer α-syn-Einschlüsse in gefährdeten Hirnregionen gekennzeichnet sind und allgemein als Synukleinopathien bezeichnet werden. Samenamplifikationsassays (SAAs), im Prionenbereich als Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) [1] und Real-Time Quaking Induced Conversion (RT-QuIC) [2] bekannt, wurden kürzlich für den Nachweis von α-Syn-Aggregaten angepasst in menschlichen biologischen Flüssigkeiten und Geweben und könnte die Diagnose von Synukleinopathien in naher Zukunft erheblich verbessern. SAAs basieren auf der Amplifikation winziger Mengen prionähnlicher α-syn-Aggregate (α-syn-Seeds), die in biologischen Matrizen vorhanden sind und sich in vitro durch Rekrutierung zusätzlicher rekombinanter α-syn-Monomere durch Zyklen der Verlängerung und Fragmentierung vermehren [3, 4 ]. Der Amplifikationsprozess wird mit Thioflavin-T (ThT) überwacht, einem Fluoreszenzfarbstoff, der mit hoher Affinität an die Cross-β-Faltblattmotive von Amyloidaggregaten bindet. Bemerkenswerterweise haben SAAs α-syn-Samen im Liquor von prodromalen PD-Fällen nachgewiesen [5, 6] und dabei eine ähnliche Empfindlichkeit erreicht wie bei Patienten mit vollständiger Erkrankung [7,8,9]. Erste Berichte zeigten Korrelationen zwischen der Aggregationsgeschwindigkeit und sowohl dem Fortschreiten der Krankheit (H&Y-Score) [1] als auch den Konzentrationen synthetischer α-syn-Aggregate im Liquor [1, 7]. Diese Ergebnisse wurden jedoch bei der Analyse größerer Kohorten nicht reproduziert [9, 10] und die Halbquantifizierung durch Reihenverdünnungen korrelierte ebenfalls nicht mit dem Fortschreiten der Krankheit [7, 9]. Es wurde beobachtet, dass Liquor sowohl von gesunden Kontrollpersonen (HC) als auch von Synucleinopathie-Fällen die α-syn-Aggregation im Vergleich zum alleinigen Puffer hemmt [1, 11, 12, 13]. Daher beinhalten SAA-Protokolle eine CSF-Verdünnung, um die Hemmung zu überwinden und eine effiziente Amplifikation von α-syn-Seeds zu ermöglichen [2, 11]. Dieser Effekt wurde wiederholt beobachtet, aber überraschenderweise noch nicht charakterisiert. Tatsächlich könnten die Auswirkungen von CSF auf die α-syn-Aggregation den offensichtlichen Mangel an Korrelation zwischen Assay-Parametern mit dem Krankheitsverlauf und der α-syn-Belastung erklären [9, 10].

In dieser Arbeit haben wir die hemmende Wirkung von CSF auf die α-syn-Aggregation umfassend charakterisiert: Wir haben zunächst eine Fraktion mit hohem Molekulargewicht (HMW) von CSF identifiziert, die den größten Teil der hemmenden Wirkung ausübt. Anschließend wählten wir mutmaßliche Inhibitoren anhand ihrer relativen Häufigkeit in der CSF-HMW-Fraktion aus und analysierten insbesondere ihre Wechselwirkungen mit α-syn, ihre Wirkung auf die α-syn-Aggregation und mögliche Auswirkungen auf α-syn-SAAs.

In der aktuellen Arbeit haben wir die hemmende Wirkung von menschlichem Liquor auf die α-syn-Aggregation mithilfe mehrerer komplementärer Techniken gründlich charakterisiert. Das Studiendesign der vorliegenden Arbeit ist in Abb. 1 zusammengefasst. Zunächst haben wir weitere Beweise gesammelt, die die Tatsache belegen, dass CSF von Natur aus in der Lage ist, die α-syn-Aggregation sowohl im SAA-Reaktionsgemisch als auch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu hemmen geimpfte und ungeimpfte Bedingungen und auf patientenabhängige Weise (Abb. 1A.1). Ausgehend von der Beobachtung, dass zwei CSF-Proben von Patienten mit Normaldruckhydrozephalus (NPH) mit deutlich unterschiedlichem Proteingehalt unterschiedliche α-syn-ThT-Fluoreszenzprofile in PBS erzeugten (Abb. 1A.2), führten wir eine Fraktionierung eines CSF-Pools durch aus neurologischen Kontrollen mittels Zentrifugalfiltern gesammelt (Abb. 1B.1). Anschließend analysierten wir verschiedene Fraktionen mittels Massenspektrometrie und Proteinaggregationstests (Abb. 1B.2–3). Wir haben festgestellt, dass die Fraktion, die einem Molekulargewicht über 100 kDa entspricht und reich an Apolipoproteinen, Albumin und Transthyretin (TTR) ist, den größten Teil der Hemmwirkung von reinem CSF beibehält. Mittels Proteinaggregationstests, Western Blot (WB), Dot Blot (DB), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Lösungskernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) haben wir festgestellt, dass Lipoproteine ​​hoher und niedriger Dichte (HDL und LDL) vorkommen ) hemmen die α-syn-Aggregation stark und interagieren wahrscheinlich mit oligomeren α-syn-Spezies (Abb. 1.C.1–3). Anschließend testeten wir den Einfluss variierender (innerhalb physiologischer Bereiche) Konzentrationen von Albumin, TTR, HDL und LDL auf ultraempfindliche diagnostische SAA (Abb. 1C.4). Anschließend verwendeten wir Immunpräzipitation (IP), um die beiden am häufigsten vorkommenden CSF-Apolipoproteine ​​(ApoA1 und ApoE) aus einem neu erstellten CSF-Pool zu entfernen und testeten die Wirkung mit Proteinaggregationstests (Abb. 1D.1). Schließlich haben wir den Gesamtproteingehalt, die ApoA1- und ApoE-Konzentrationen in SAA-negativen CSF-Proben einer kleinen Kohorte neurologischer Kontrollen und wiederholtes SAA an denselben Proben gemessen, die mit vorgeformten Aggregaten versetzt waren, um eine mögliche Korrelation zwischen den kinetischen SAA-Parametern und dem CSF-Gesamtproteingehalt zu bewerten. ApoA1- und ApoE-Konzentrationen (Abb. 1D.2).

Escherichia coli BL21 (DE3) Gold wurden mit einem pT7-7-Vektor transformiert, der mit dem für α-syn kodierenden Gen kloniert war. Die Vorkultur transformierter Zellen über Nacht wurde 100-fach in LB-Medium verdünnt und bei einem OD600-Wert von 0,6–0,8 mit 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactosid induziert; Nach 5-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen bei 4000 U/min geerntet (JA-10, Beckman Coulter). Die Extraktion wurde durch osmotischen Schock unter Verwendung von 100 ml Puffer Tris 30 mM, EDTA 2 mM und Saccharose 40 % bei pH 7,2 nach Shevchik et al. durchgeführt. [14] und Huang et al. [15].

Die Suspension wurde dann 25 Minuten lang bei 20.000 U/min ultrazentrifugiert (Rotor Typ 70 Ti, Beckman Coulter), und das Pellet wurde gesammelt und mit 90 ml vorgekühltem Reinstwasser, das 38 μl 1 M MgCl2 enthielt, resuspendiert und dann ultrazentrifugiert zweites Mal. Die aus diesen beiden Zentrifugationsschritten stammenden Überstände wurden vereinigt und gegen 4 l 20 mM Tris/HCl-Puffer bei pH 8,0 dialysiert. Das Protein wurde dann in das schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographiesystem geladen und die Anionenaustauschchromatographie wurde mit 0–50 % linearem Gradienten 1 M NaCl (GE Healthcare HiPrep Q HP 16/10-Säule) durchgeführt. Die gesammelten Fraktionen wurden lyophilisiert und zur chemischen Denaturierung in 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA und 8 M Harnstoff bei pH 8,0 resuspendiert. Um das gesamte Protein, das Aggregate bildete, zu entfernen, wurden zwei Größenausschlusschromatographien (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg-Säule) mit 20 mM Phosphat und 0,5 mM EDTA bei pH 8,0 als Elutionspuffer durchgeführt. Gereinigtes α-syn wurde gegen Milli-Q-Wasser dialysiert und zur Langzeitlagerung in Chargen lyophilisiert. Der vollständige Roche-Protease-Inhibitor-Cocktail wurde erst während des Extraktionsschritts in der vom Hersteller empfohlenen Menge zugesetzt.

15N-markiertes Wildtyp-α-syn wurde in Escherichia coli exprimiert, das in M9-Minimalmedium, ergänzt mit 15NH4Cl, gezüchtet und wie für E. coli in LB-Medium begonnen gereinigt wurde.

Für 15N-markiertes und unmarkiertes α-syn wurden die Proteinexpression und -reinigung wie zuvor beschrieben durchgeführt [16]. Zur Überprüfung der Qualität des gereinigten Proteins wurden 1H-Lösungs-NMR, Gelelektrophorese und Silberfärbung verwendet. Ein Bild von zwei wiederholten Silberfärbungsexperimenten, die mit dem gereinigten α-syn nach einem und zwei (in Proteinaggregationstests verwendeten) Größenausschlusschromatographieschritten durchgeführt wurden, ist in Abb. S1 (Ergänzungsmaterial) dargestellt.

Für TTR wurden Escherichia coli BL21(DE3) RIPL PLysS-Zellen mit dem für das TTR-Gen kodierenden pET-28a(+)-Plasmid transformiert. Die Zellen wurden in LB-Medium mit 0,1 mg/ml Kanamycin kultiviert, bei 37 °C gezüchtet, bis die OD600 0,6–0,8 erreichte, und dann mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid induziert. Sie wurden über Nacht bei 37 °C weiter gezüchtet und dann durch 15-minütige Zentrifugation bei 6500 U/min (JA-10 Beckman Coulter) bei 4 °C geerntet. Das Pellet wurde in 20 mM Tris-HCl, pH 8,5 (60 ml pro Liter Kultur) suspendiert und 40 Minuten lang bei 4 °C beschallt. Die Suspension wurde 40 Minuten lang bei 40.000 U/min (F15-6 × 100y Thermo Scientific) zentrifugiert und das Pellet verworfen. TTR wurde durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer HiPrep Q FF 16/10-Säule (GE Healthcare Life Science) gereinigt. Das Protein wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8,6 mit einem linearen 0–1 M NaCl-Gradienten eluiert. Fraktionen, die reines TTR enthielten, wurden durch Coomassie-Färbung von SDS-PAGE-Gelen identifiziert, dann zusammengefügt und durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von HiLoad Superdex 26/60 75 pg in 50 mM Phosphatpuffer bei pH 7,5 gereinigt.

Die in dieser Arbeit verwendeten neurologischen Kontroll-CSF-Proben (NC) wurden zuvor gesammelt und gemäß internationalen Richtlinien bei -80 °C gelagert [17]. NC waren kognitiv unbeeinträchtigte Probanden, die sich an das Zentrum für Gedächtnisstörungen der Universität Perugia (Perugia, Italien) wandten und sich einer Lumbalpunktion wegen subjektiver Gedächtnisbeschwerden unterzogen, die nicht durch die neuropsychologische Untersuchung bestätigt wurden, oder im Rahmen einer diagnostischen Abklärung wegen geringfügiger neurologischer Störungen Symptome (z. B. Kopfschmerzen, periphere Neuropathie, psychiatrische Störungen), die nach einer Nachbeobachtungszeit von mindestens 2 Jahren keine kognitive Beeinträchtigung zeigten. Alle ausgewählten NC-Proben wurden sowohl auf klassische AD-CSF-Biomarker (Amyloid 1–40- und 1–42-Peptidverhältnis, Gesamt-Tau und T181-phosphoryliertes Tau) [18] als auch auf α-syn-SAA [19] negativ getestet.

CSF von 19 verschiedenen NC-Probanden (10 Frauen und 9 Männer, Durchschnittsalter = 70 Jahre, Standardabweichung = 8 Jahre) wurden gepoolt (CSF-Pool 1) und erreichten ein Gesamtvolumen von 8 ml, das in 2 Aliquots von 3 ml und 10 ml aufgeteilt wurde Aliquots von 0,2 ml.

Ein zweiter CSF-Pool von 5 ml wurde aus verschiedenen CSF-Proben von n = 10 NC-Probanden (5 Frauen und 5 Männer, Durchschnittsalter = 69 Jahre, Standardabweichung = 5 Jahre) hergestellt. Dieser zweite Pool wurde dann in 10 Aliquots zu je 0,5 ml aufgeteilt, die dann für ApoA1- und ApoE-Immundepletionsexperimente und Proteinaggregationstests verwendet wurden.

Zwei Aliquote von 0,5 ml relativ zu 31 CSF-Proben, die von NC-Probanden (7 Frauen und 24 Männer, Durchschnittsalter = 69 Jahre, Standardabweichung = 8 Jahre) entnommen wurden, wurden für ApoA1- und ApoE-ELISAs, Gesamtproteinmessungen und SAA-Experimente ausgewählt.

CSF, der von gesunden Kontrollpersonen (HC) und PD-Probanden gesammelt wurde, wurde verwendet, um erste α-syn-Seed-Spikexperimente durchzuführen und die Auswirkungen der Zugabe von HDL, LDL, HSA und TTR bei Amprion Inc. (San Diego, CA, USA) zu testen. Die in Abb. 2A gezeigten HC1-6-Proben, die in den in Abb. 2A gezeigten α-syn-Samen-Spikexperimenten verwendet wurden, wurden von Biochemed Services (Winchester, VA, USA) erworben und von 3 männlichen und 3 weiblichen Probanden (Alter = 26–39 Jahre) gesammelt. In Bezug auf die in Abb. 8 zusammengefassten Experimente wurden HC22 (weiblich, Alter = 35 Jahre) und HC24, HC66, HC67 (alle Männer, Alter = 30–35 Jahre) ebenfalls von Biochemed Services erworben. Alle reinen HC-CSF-Proben wurden in α-syn-SAA negativ getestet. Unter Bezugnahme auf dieselben Experimente gehörten PD10-, PD34- und PD62-CSF-Proben (alle Männer, Alter = 72–79) PD-Patienten mit einem Hoehn- und Yahr-Stadium (H&Y) von 2 und wurden von PrecisionMed (Carlsbad, CA, USA) erworben ). PD47 (PD-Patient, weiblich, Alter = 62 Jahre, H&Y = 1,5) wurde stattdessen von BioIVT (Westbury, NY, USA) gekauft. Alle reinen PD-CSF-Proben wurden positiv auf α-syn-SAA getestet.

Ein Aliquot von 3 ml CSF-Pool 1 wurde in 1,5 ml PBS 3 × resuspendiert, um 4,5 ml humanen gepoolten CSF in PBS 1x zu erhalten. Dieses Volumen wurde dann einer Reihe von Filtrationen unter Verwendung von Amicon® Ultra-4 Molekulargewichts-Cut-off-Filtern (MWCO) unterzogen. Das zur Fraktionierung von menschlichem CSF verwendete Verfahren ist in Abb. 4A schematisch dargestellt. Die auf diese Weise gesammelten Aliquots enthielten die verschiedenen Bestandteile der anfänglichen 4,5 ml CSF in PBS mit unterschiedlichen Konzentrationsfaktoren. Das Volumen und die relativen Konzentrationsfaktoren (in Bezug auf Fraktion 1) der in Abb. 4A dargestellten Aliquots sind in der Tabelle zusammengefasst S1. Die Aliquots 2, 3, 4 und 5 wurden vor der Lagerung dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit α-syn-Monomeren für alle CSF-Fraktionen getestet. Die verschiedenen Konzentrationsfaktoren wurden durch Verdünnen der Proben mit PBS angepasst (siehe Ergänzungsmaterialtabelle S1).

Vorgeformte α-syn-Aggregate wurden durch Inkubation von 1 mg/ml α-syn in PBS für eine Woche bei 37 °C unter kräftigem Doppelorbitalschütteln (500 U/min) in einem verschlossenen 1,5-ml-Polypropylenfläschchen erzeugt. Die Endprodukte wurden Ultraschallzyklen (20 s Spitzenbeschallung, 20 s Pause) mit einer Amplitude von 12 μm unterzogen. Das Polypropylenfläschchen war während der gesamten Dauer des Ultraschallverfahrens in Eis getaucht. Die Aggregate wurden dann auf 0,25, 2,5, 25, 250 und 2500 pg/μL verdünnt, wobei die anfängliche Monomerkonzentration als Referenz diente. Die erzeugten α-syn-Aggregate wurden dann aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

Die Proben wurden wie zuvor berichtet analysiert [19, 20]. Kurz gesagt, CSF-Proben wurden in dreifacher Ausfertigung (40 µL/Well) in einer 96-Well-Platte (COSTAR 96, Kat.-Nr. 3916) in einem Reaktionsgemisch bestehend aus 0,3 mg/ml rekombinantem α-syn (Amprion, Kat.-Nr. S2020), 100 mM PIPES pH 6,50 (Sigma, Kat.-Nr. 80.635), 500 mM NaCl (Lonza, Kat.-Nr. 51.202), 10 µM ThT (Sigma, Kat.-Nr. T3516) und eine 3/32-Zoll BSA-blockierte Si3N4-Perle (Tsubaki Nakashima). ). Die Perlen wurden mit 1 % BSA in 100 mM PIPES, pH 6,50, 1 Stunde lang blockiert, zweimal mit 100 mM PIPES, pH 6,50, gewaschen und über Nacht getrocknet. Dieser Test wurde in einem BMG FLUOstar Omega-Schüttler/Lesegerät bei 37 °C durchgeführt. Die Platten wurden 150 Stunden lang alle 30 Minuten 60 Sekunden lang geschüttelt. Die Testergebnisse des Tests sind positiv, nicht schlüssig oder negativ, basierend auf einem probabilistischen Algorithmus, der maximale Fluoreszenz- und Kinetikparameter verwendet [19]. Im Vergleich zu anderen in dieser Arbeit durchgeführten Proteinaggregationstests verwendete der ultraempfindliche diagnostische SAA ein anderes αSyn-Substrat (C-terminales Histag), das durch Standard-IMAC-Verfahren (Amprion, Kat.-Nr. S2020) gereinigt wurde (19, 20).

Die Proteinaggregationsexperimente zur Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen α-syn und CSF-Bestandteilen wurden mit einem programmierbaren BMG LABTECH ClarioStar® Fluorometer in Greiner-96-Well-Platten mit klarem Boden (Kat.-Nr. 655.906) durchgeführt. Die ThT-Fluoreszenz wurde von unten mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 450 bzw. 480 nm abgelesen. Für alle Experimente wurde eine Inkubationstemperatur von 37 °C verwendet. Um einen Überlauf des Analog-Digital-Wandlers zu vermeiden, wurden leicht unterschiedliche Verstärkungswerte verwendet. In jedem Experiment wurde lyophilisiertes rekombinantes α-syn in 3 mM NaOH bei einer Konzentration von 3,5 mg/ml aufgetaut. Die Lösung wurde durch Verdünnen mit konzentrierter PBS (4x) und destilliertem Wasser auf einen physiologischen pH-Wert gebracht. In allen beschriebenen Experimenten betrug das endgültige Reaktionsvolumen 200 μl, die α-syn-Endkonzentration 0,7 mg/ml und die ThT-Endkonzentration 10 μM. Um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, war unter allen getesteten Bedingungen auch 0,1 % NaN3 vorhanden. Alle Reaktionen wurden bei 37 °C in versiegelten Platten durchgeführt. Jede Bedingung wurde mindestens dreifach getestet.

158 μl der Lösung, die das Monomer α-syn enthielt, wurden in Vertiefungen gegossen, von denen jede 6 Glasperlen mit einem Durchmesser von 1 mm enthielt. Je nach Experiment wurden 40 μl menschlicher gepoolter/NPH-CSF, 40 μl PBS oder 40 μl CSF-Fraktionen hinzugefügt. In geimpften Experimenten wurden 2 μl PBS mit 0, 0,25, 2,5, 25, 250 und 2500 pg/μl α-syn-Aggregaten hinzugefügt. Die Platten wurden versiegelt und im Fluorometer Schüttelzyklen unterzogen (1 Minute doppelorbitales Schütteln bei 500 U/min, 14 Minuten Pause).

Um die Ergebnisse mit denen einer zuvor veröffentlichten Arbeit zu vergleichen, wurde das Experiment genau so durchgeführt, wie es in Bellomo et al. beschrieben ist. [16]. In Bezug auf die oben beschriebenen Experimente bestand der einzige nennenswerte Unterschied in der Anwendung eines Schüttel-/Inkubationsprotokolls mit 29 Minuten Ruhe und 1 Minute Schütteln. Zusätzlich zu HSA (Sigma Aldrich, A1653) wurden auch Vertiefungen analysiert, die 0,12 mg/ml und 0,57 mg/ml menschliches Serum-HDL (Sigma Aldrich, LP3) mit und ohne α-syn enthielten.

In diesen Experimenten wurden 40 μl Lösungen mit unterschiedlichen Verdünnungen (alle Produkte wurden mit destilliertem H2O verdünnt) von Humanserum-HDL (Sigma-Aldrich LP3), Humanserum-LDL (Sigma-Aldrich LP2) und rekombinantem TTR zugesetzt. Jede Bedingung wurde in 3 verschiedenen Vertiefungen in Gegenwart und Abwesenheit von α-syn repliziert. Für die Experimente, in denen wir die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Humanserum-HDL (0, 0,003, 0,03, 0,3 und 1 mg/ml) testeten, wurde die Platte versiegelt und Zyklen von 1-minütigem doppelorbitalem Schütteln bei 500 U/min unterzogen, 14 Minute Ruhe. Für die Experimente, in denen wir die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Humanserum HDL (0,3 mg/ml), LDL (0,03 und 0,3 mg/ml) und TTR (1,0, 0,3 und 0,03 mg/ml) testeten, wurde das Schüttelprotokoll geändert 2 Min. doppelorbitales Schütteln bei 500 U/min und 13 Min. Ruhe bei 37 °C.

Während der bei Amprion Inc. durchgeführten ultraempfindlichen SAA-Experimente wurden alle 30 Minuten Fluoreszenzwerte erfasst, um kinetische Parameter mit hoher Genauigkeit abzuschätzen. Das folgende 4-Parameter-Sigmoid wurde verwendet, um die rohen Fluoreszenzmesswerte anzupassen:

Dabei ist Fmin die minimale Fluoreszenz, Fmax die maximale Fluoreszenz, T50 die Zeit bis zum Erreichen von 50 % Fmax, S die Steigung und t die Zeit. Für jede Anpassung wurde das Bestimmtheitsmaß (R2) berechnet. Das α-syn-SAA-Ergebnis jeder CSF-Probe wurde mithilfe eines probabilistischen Algorithmus bestimmt:

Dabei ist Ppos die Wahrscheinlichkeit, dass ein Replikat positiv ist, A = -4,02, B = 2,98, C = 1,87 und Fmax5000 und Rsquare93 binäre Werte abhängig von einem Schwellenwert. Wenn der Fmax eines bestimmten Replikats über 5.000 RFU liegt, dann ist Fmax5000 = 1, sonst 0. Wenn der R2 für die Anpassung des 4-Parameter-Modells an die Fluoreszenzdaten über 0,93 liegt, dann ist Rsquare93 = 1, sonst 0. Die Koeffizienten A, B und C wurden anhand einer Datenbank mit mehr als 900 Aggregationskurven geschätzt. Unter den PD- und HC-Proben in der Datenbank zeigten Fmax und R2 statistisch signifikante Unterschiede (p-Wert < 0,001 für jede dieser Variablen). Wenn die Wahrscheinlichkeit für Positivität (Ppos) höher als 0,12 ist, wird das Replikat als positiv bestimmt, andernfalls als negativ. Da CSF-Proben dreifach analysiert wurden, wurde die CSF-Probe als positiv bezeichnet, wenn alle drei Replikate positiv waren. Wenn keines oder nur ein Replikat positiv war, wurde die CSF-Probe als negativ bezeichnet. Wenn zwei Replikate positiv waren und der durchschnittliche Fmax der drei Replikate weniger als 5.000 RFU (oder au) betrug oder der Variationskoeffizient (CV) höher als 110 war, wurde die Probe auch als negativ bezeichnet.

Die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz, die von drei Vertiefungen erzeugt wurde, die den Analyten ohne α-syn enthielten, wurde vor der Analyse von den ThT-Intensitätsprofilen relativ zu demselben Analyten in Gegenwart von α-syn abgezogen. Bei der Analyse der Daten bezüglich des einzigen α-syn wurde die Hintergrundfluoreszenz der Vertiefung, die nur den Reaktionspuffer enthielt, abgezogen. Jede kinetische ThT-Spur wurde dann mit Origin Pro v9.0 mit einer doppelten Sigmoidfunktion ausgestattet. Im Anpassungsmodell passt A2 zum Fluoreszenzwert des zweiten Plateaus, A1 zum Fluoreszenzwert des ersten Plateaus und A0 zur Grundlinienfluoreszenz. Die Zeitparameter t1 und t2 passen zum ersten bzw. zweiten Wendepunkt, während d1 und d2 die Steigungen der Sigmoide darstellen. Bei dem verwendeten nichtlinearen Anpassungsverfahren wurden die folgenden Grenzen angewendet: 0 < A0 < 1000, 500 < A1 < 5000, A2 > 2000, 0 < t1 < 100 h und t2 > 0. Bei einigen kinetischen Spuren kam es zu einer Abnahme von Nach Erreichen des zweiten Plateaus wurde Fluoreszenz beobachtet. Dieses bekannte Phänomen wird durch die Sequestrierung von ThT-Molekülen durch reife Fibrillen und durch die Sedimentation von HMW-unlöslichen Aggregaten verursacht [21]. In diesen Fällen wurde vor der Montage der letzte absteigende Teil des ThT-Profils entfernt. Die Anpassung wurde abgelehnt, wenn der angepasste Bestimmungskoeffizient R2 unter 0,3 lag.

Gleiche Mengen an Testprodukten (Volumina mit 2 µg α-syn) wurden mit Laemmlis Probenpuffer ohne Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzugefügt, ohne sie zu kochen, um die Solubilisierung von SDS-empfindlichen Aggregaten zu verhindern. Die Proben wurden durch SDS-PAGE auf 4–20 % Polyacrylamidgelen (Bio-Rad) aufgetrennt und durch Nasstransfer bei konstanter 100 V für 90 Minuten unter Verwendung von 25 mM Tris-HCl, 192, in PVDF-Membranen (0,45 μm, Bio-Rad) übertragen mM Glycin, 20 % Methanol und 0,015 % SDS. Die Membranen wurden 30 Minuten lang mit 4 % PFA fixiert, bevor sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Milch in TBS-T (TBS mit 0,1 % Tween 20) blockiert wurden. Nach dem Blockieren wurden die Filter mit primärem Antikörper gegen α-syn (211, sc-12767, Santa Cruz Biotechnology) O/N bei 4 °C inkubiert. Die Membranen wurden weiter mit einem sekundären Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat-Antikörper (Bio-Rad, 1.706.516; 1:5.000) 1 Stunde lang bei RT inkubiert, und die Signale wurden mithilfe einer ECL-Reaktion sichtbar gemacht. Die densitometrische Analyse wurde mit der ImageJ-Software (National Institute of Health) durchgeführt. Dot-Blot-Bilder wurden invertiert und Fenster/Ebene wurden vor der Analyse angepasst. Ein rechteckiger Interessenbereich (ROI) wurde verwendet, um die durchschnittliche Graustufenintensität in jeder Bande im Verhältnis zum monomeren α-syn zu messen. Anschließend wurde der durchschnittliche Grauwert eines äquivalenten ROI, der keine Bänder enthielt, subtrahiert. Um den ungefähren Prozentsatz des verbleibenden α-syn-Monomers abzuschätzen, wurde die durchschnittliche Intensität der WB-Banden durch diejenige bei t = 1 h geteilt.

Für das Dot-Blotting wurden Aliquots der in SAAs erhaltenen Produkte, die 300 ng des Monomers α-syn in den anfänglichen Reaktionsmischungen entsprachen, auf eine mit TBS-T voräquilibrierte Nitrozellulosemembran getupft (2 μl/Spot). Die Proben wurden bei RT getrocknet und 30 Minuten lang mit PFA (0,4 % in PBS) fixiert, und dann wurden die Filter mit 2 % fettfreier Milch (in TBS-T) blockiert. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit OC- (1:1000) oder A11- (1:1000) Konformationsantikörpern inkubiert [22], gefolgt von einer Inkubation mit Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (1:5000; 1.706.515 Bio-Rad ) Sekundärantikörper für 1 Stunde bei RT. Membranen wurden mit einer ECL-Reaktion entwickelt und Bilder wurden mit einem ChemiDoc™-Bildgebungssystem aufgenommen. Dot-Blot-Bilder wurden invertiert und Fenster/Ebene wurden vor der Analyse angepasst. Die durchschnittliche Graustufenintensität wurde aus einem kreisförmigen ROI extrahiert, der alle α-syn-haltigen Proben enthielt. Für jeden Punkt wurde die durchschnittliche Graustufenintensität eines benachbarten ROI, der keinen Punkt enthielt, subtrahiert, um die Hintergrundintensität zu entfernen. Die gemittelte und vom Hintergrund abgezogene Graustufenintensität wurde dann für die ROI-Fläche in cm2 multipliziert, um die integrierte Dichte abzuschätzen. Bei der Wiederholung des gleichen Verfahrens für Kontrollproben, die kein α-syn enthielten, wurden keine signifikanten Grauwertschwankungen festgestellt.

Eine Immunpräzipitation (IP) wurde durchgeführt, um ApoA1 und ApoE aus der CSF-Poolprobe zu entfernen. 50 µL abgesetztes immobilisiertes Protein A/G (100 µL Harzaufschlämmung, Pierce™ Protein A/G Plus Agarose, ThermoFisher Scientific™, USA) und 60 µg Anti-ApoA1-Antikörper (MIA1404, ThermoFisher Scientific™, USA) wurden kombiniert ein 2-ml-Röhrchen. Die Perlen-Antikörper-Aufschlämmung wurde 4 Stunden lang bei 4 °C (konstante Rotation) inkubiert. Das Röhrchen wurde 2 Minuten lang bei 4 ° C und 1.000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Perlenpellet wurde zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Ebenso 50 µL abgesetztes immobilisiertes Protein A/G (100 µL Harzaufschlämmung, Pierce™ Protein A/G Plus Agarose, ThermoFisher Scientific™, USA) und 20 µg Anti-ApoE-Antikörper (PA5-27,088, ThermoFisher Scientific™, USA). ) wurden in ein 2-ml-Röhrchen gegeben. Die Perlen-Antikörper-Aufschlämmung wurde 4 Stunden lang bei 4 °C (konstante Rotation) inkubiert. Das Röhrchen wurde 2 Minuten lang bei 4 ° C und 1.000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Perlenpellet wurde zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden ApoA1-Antikörper-gebundene Perlen und ApoE-Antikörper-gebundene Perlen in einem einzigen 2-ml-Röhrchen kombiniert. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und 2 Minuten lang bei 4 ° C und 1000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und 400 µL CSF-Pool wurden dem Röhrchen mit Perlen hinzugefügt. Die Probe wurde über Nacht bei 4 °C (konstante Rotation) inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die CSF-Perlenaufschlämmung zentrifugiert (1.000 × g für 2 Minuten bei 4 °C) und der Überstand und das Perlenpellet wurden zur weiteren Analyse getrennt gesammelt. Parallel dazu wurde eine Kontrollprobe hergestellt, indem das gleiche Verfahren auf Perlen ohne an IP gebundenen Anti-ApoA1- oder Anti-ApoE-Antikörper angewendet wurde. Kurz gesagt, 50 µL reine Harzaufschlämmung wurden in ein 2-ml-Röhrchen überführt und zweimal mit PBS gewaschen. Nach dem zweiten Waschzyklus wurde PBS entfernt und stattdessen 400 µL CSF-Pool hinzugefügt. Die Probe wurde über Nacht bei 4 °C (konstante Rotation) inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die Probe zentrifugiert (1.000 × g für 2 Minuten bei 4 °C) und der Überstand und das Kügelchenpellet wurden zur weiteren Analyse getrennt gesammelt. Die Leistung von ApoA1 und ApoE IP wurde mittels Western Blot bewertet. Kurz gesagt, alle Proben (1. IP-CSF-Pool-Probe, 2. CSF-Pool-Probe, die einem Verfahren unterzogen wird, das IP nachahmt (ohne Antikörper), 3. Bead-Pellet der IP-CSF-Pool-Probe, 4. Bead-Pellet der CSF-Pool-Probe, das einem Verfahren unterzogen wird, das IP nachahmt ( ohne Antikörper), 5. reine CSF-Poolprobe, die keiner Behandlung unterzogen wurde) wurden in einem reduzierenden Beladungspuffer resuspendiert und 5 Minuten bei 95 °C gekocht (Thermoblock). Röhrchen mit Kügelchenpellet (Proben 3. und 4.) wurden zentrifugiert und der Überstand gesammelt und für die weitere Analyse verwendet. Ein 12 %iges Polyacrylamidgel wurde hergestellt und die Proben wurden unter reduzierenden Bedingungen getestet. Alle Proben wurden vom Gel auf eine Nitrozellulose-Blotmembran (SF110B, Himedia, Indien) übertragen. Die Qualität der Übertragung wurde anhand der reversiblen Ponceau-S-Färbung bewertet. Die Membran wurde blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C (Schüttelgerät) mit den ausgewählten Primärantikörpern (MIA1404 für ApoA1, PA5-27.088 für ApoE, 1:1000), verdünnt in 5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,02 % NaN3, sondiert Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween®20 (Sigma-Aldrich, USA) (TBST) mit Zusatz von Phenolrot als pH-Indikator. Nach der Inkubation wurde die Membran mit TBST gewaschen und die 1:5000 in einem Blockierungspuffer verdünnten Sekundärantikörper wurden 1 Stunde lang bei RT aufgetragen. Abhängig von den verwendeten Primärantikörpern Ziegen-Anti-Maus (170–6516, Bio-Rad, USA) (für MIA1404) oder Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (170–6515, Bio-Rad, USA) (für PA5-27.088). ) wurden hinzugefügt. Die Signalentwicklung wurde unter Verwendung der verstärkten Chemilumineszenzlösung (ECL) (SuperSignal™ West Pico Plus, ThermoFisher Scientific™, USA) durchgeführt.

Die CSF-Spiegel von ApoA1 und ApoE wurden unter Verwendung der kommerziell erhältlichen ELISA-Kits – Human Apolipoprotein AI ELISA Kit, ab108803 und Human Apolipoprotein E ELISA Kit, ab108813 (Abcam, UK) in n = 31 SAA-negativen NC CSF-Proben bestimmt. Beide Tests wurden gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Alle Standardkurvenpunkte und CSF-Proben wurden doppelt untersucht. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm (Wellenlängenkorrektur 570 nm) mit dem Plattenlesegerät Clariostar (BMG Labtech, Deutschland) abgelesen. Das 4-Parameter-Logistikmodell wurde angewendet, um eine Standardkurve zu erstellen und die Konzentrationen der analysierten CSF-Proben zu interpolieren.

Der Gesamtproteingehalt wurde in denselben Proben unter Verwendung des Pierce™ 660 nm Protein Assay Reagent cat bewertet. 22.660 (Thermo Scientific™, USA). Der Test wurde gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Als Standard zur Berechnung des Gesamtproteingehalts von CSF-Proben diente ein Satz BSA-Verdünnungen bekannter Konzentrationen. Alle Standardkurvenpunkte und CSF-Proben wurden doppelt untersucht.

Bei der Bewertung der Unterschiede zwischen angepassten kinetischen Parametern für verschiedene Proben wurden eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und ein Tukey-Post-hoc-Test für Mittelwertvergleiche angewendet. Die Korrelation zwischen der hinzugefügten Samenmasse und den T2-Parametern wurde nach Spearman berechnet. Beim Vergleich angepasster integrierter Dichten von Dot-Blot-Bildern wurde der zweiseitige Student-T-Test angewendet. Der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) wird in jedem Bild mit Balkendiagrammen und/oder durchschnittlichen Fluoreszenzprofilen angegeben. Bei der Analyse von Massenspektrometriedaten wurde eine Falscherkennungsrate (FDR) von 1 % festgelegt und das Kriterium für die Akzeptanz der Proteinidentifizierung umfasste eine von der Software sortierte Wahrscheinlichkeitsbewertung. Korrelationen zwischen SAA-Parametern und Log2-transformierten CSF-Spiegeln von ApoA1, ApoE und Gesamtprotein wurden mithilfe der Pearson-Korrelationskoeffizienten berechnet. Für die hierarchische Gruppierung von Korrelationen wurde das Ward-Linkage-Kriterium angewendet.

Eine detaillierte Beschreibung des Studiendesigns (Versuchsart und Ablauf) finden Sie in Abschn. 2.1 von Material und Methoden und grafisch zusammengefasst in Abb. 1.

Schema, das die Pipeline und die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Techniken zusammenfasst. Symbollegende. TEM: Transmissionselektronenmikroskopie; ThT: Thioflavin-T-Protein-Aggregationstest; SAA: α-Synuclein-Seed-Amplifikationsassay; 1H-NMR: Lösungs-Protonen-Magnetresonanzspektroskopie; MS: Massenspektrometrie; ZENTR. FILTER: Zentrifugalfilter; 1H-15N NMR: 2D-Kernresonanzspektroskopie mit Protonen-Stickstoff-Lösung; DB: Dot-Blot-Assay; WB: Western-Blot-Assay; IP: Immunpräzipitation; ELISA: Enzymimmunoassay

Die CSF-Hemmung der α-syn-Aggregation in SAAs ist nach wie vor kaum charakterisiert, obwohl bereits in der Literatur darüber berichtet wurde [1, 2, 11, 12]. Wir haben 20 fg synthetischer α-syn-Aggregate (synthetische Samen) in den Liquor gesunder Kontrollpersonen (HC) gegeben, um festzustellen, ob die Liquorhemmung bei allen Liquor ähnlich und intrinsisch ist oder ob sie subjektabhängig ist. Diese versetzten Proben wurden in einem hochempfindlichen und spezifischen diagnostischen α-syn-SAA analysiert, der von Concha-Marambio et al. entwickelt wurde. [19, 20]. Obwohl synthetische Samen bekanntermaßen auf sehr reproduzierbare Weise aggregieren, wenn sie nur in Puffer gegeben werden, war die Aggregationskinetik je nach CSF-Spender sichtbar unterschiedlich (Abb. 2A). Unter diesen experimentellen Bedingungen weist die geimpfte α-syn-Aggregation eine einzelne Verlängerungsphase und ein Plateau auf, wobei die Zeit bis zum Erreichen von 50 % des Fluoreszenzplateaus (T50) die Geschwindigkeit der Reaktion beschreibt. Die T50-Werte unterschieden sich signifikant zwischen den verschiedenen CSF-Proben (p < < 0,001, siehe ergänzendes Material, Abb. S2). Der am wenigsten hemmende CSF (Nr. 1) ermöglichte eine etwa 50 % schnellere Amplifikation der synthetischen Samen als der am stärksten hemmende CSF (Nr. 3) (Ergänzungsmaterial Abb. S2). CSF-Proben ohne synthetische Samen zeigten unter diesem Protokoll keine spontane Aggregation. Wir beschlossen dann, diese Hemmung durch ThT-Fluoreszenz in einem vereinfachten Proteinaggregationsassay weiter zu charakterisieren, um die hemmende Wirkung von CSF, sogar auf die spontane α-syn-Aggregation, in einem Puffer mit physiologischem pH-Wert und physiologischer Ionenstärke (PBS) besser hervorzuheben. Ein Pool von CSF-Proben, die von neurologischen Kontrollen (NC) gesammelt wurden, wurde dem α-syn/PBS-Reaktionsgemisch in Abwesenheit synthetischer Keime zugesetzt, um zu bewerten, ob die CSF-Hemmung die spontane α-syn-Aggregation unterdrücken könnte. Unter diesen Versuchsbedingungen blockierte CSF die spontane Aggregation von α-syn vollständig (Abb. 2B). Anschließend verglichen wir die CSF-Hemmung mit Seed-Amplifikationsreaktionen in PBS-Puffer bei Zugabe verschiedener Mengen synthetischer Seeds (0,5 pg – 5 ng) und stellten fest, dass CSF die Seed-Aggregation von α-syn behinderte, selbst wenn hohe Konzentrationen synthetischer α-syn-Seeds verwendet wurden ( 5 ng), während Reaktionen ohne CSF eine reproduzierbare Keimaggregation in allen getesteten Konzentrationen ermöglichten (Abb. 2C). Interessanterweise zeigten unter diesen physikalisch-chemischen Bedingungen sowohl die Keim- als auch die spontane Aggregation zwei Dehnungsphasen und zwei Plateaus (Abb. 2C, Einschub), die durch eine Doppel-Sigmoid-Funktion beschrieben werden konnten (Abb. 2D). Der Wendepunkt der zweiten Elongationsphase (t2) wurde mithilfe einer Doppel-Sigmoidal-Anpassung geschätzt und mit der logarithmischen Masse synthetischer Samen korreliert (Ergänzungsmaterial, Abb. S3), in Übereinstimmung mit früherer Literatur [1, 12]. Um unsere experimentellen Bedingungen in PBS weiter zu charakterisieren, analysierten wir Proben von beiden Plateaus der Aggregationskurve mittels TEM. Im ersten Plateau sind nur kurze und teilweise amorphe Aggregate vorhanden, während im zweiten Plateau eine hohe Anzahl fibrillärer Strukturen zu beobachten ist (Abb. 2E).

CSF hemmt die α-syn-Aggregation in ungeimpften und geimpften Bedingungen auf patientenabhängige Weise. A Sechs verschiedene humane HC-CSF-Proben (40 µL), versetzt mit 20 fg synthetischen vorgeformten α-Syn-Fibrillen (Samen) und analysiert unter diagnostischen SAAs-Bedingungen: 0,3 mg/ml (19,6 µM) rekombinantes α-Syn in 100 mM PIPES, pH 6,5 und 500 mM NaCl, 200 µL Endvolumen. B Proteinaggregationstest, durchgeführt unter Verwendung von 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS mit (schwarz) und ohne (rot) 40 μl NC-CSF-Pool (Endvolumen 200 μl). C Samenamplifikationsassay in PBS verschiedener Mengen synthetischer Samen (0,5, 5, 50, 500 und 5.000 pg) mit und ohne NC-gepooltem CSF (nur 3 Samenmassen dargestellt). D Grafische Beschreibung der verwendeten Anpassungsfunktion. A2 passt zum Fluoreszenzwert des zweiten Plateaus, A1 passt zum Fluoreszenzwert des ersten Plateaus und A0 passt zur Grundlinienfluoreszenz. Die Zeitparameter t1 und t2 passen zum ersten bzw. zweiten Wendepunkt, während d1 und d2 die Steigungen der Sigmoide darstellen. E Proteinaggregationstest, durchgeführt mit 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS (Endvolumen 200 μl). In jede Vertiefung wurden sechs Glasperlen mit einem Durchmesser von 1 mm gegeben. Das Schüttel-/Inkubationsprotokoll bestand aus 1-minütigem Schütteln bei 500 U/min und 14-minütigem Ruhen bei 37 °C. Das Experiment wurde fünffach durchgeführt; Drei Replikate wurden verwendet, um das oben angegebene durchschnittliche Aggregationsprofil zu erstellen, die anderen beiden Replikate wurden bei t = 35 h und t = 165 h von der Platte gesammelt und mittels TEM analysiert, um die repräsentativen Bilder zu erzeugen, die unten in Panel E gezeigt sind. . Alle ThT-Fluoreszenzspuren werden als durchschnittliche Intensität über 3 Replikate dargestellt, wobei Fehlerbalken SEM darstellen

Liquor von kognitiv unbeeinträchtigten Normaldruckhydrozephalen (NPH) ist normalerweise in großen Mengen verfügbar und wird häufig für die Testentwicklung oder als Negativkontrollen in diagnostischen SAAs verwendet. Obwohl sie aufgrund des Fehlens nachweisbarer α-syn-Samen als Negativkontrollen gelten, wurde berichtet, dass es bei NPH-Patienten häufig zu einer Verdünnung von CSF-Bestandteilen kommt [23], was relevante Auswirkungen auf die α-syn-Aggregation haben könnte. Daher untersuchten wir die Wirkung von CSF aus 2 NPH-Fällen auf die spontane α-syn-Aggregation, um festzustellen, ob sie die mit NC-CSF beobachtete Hemmwirkung reproduzierten (Abb. 3A). Bemerkenswerterweise wurde bei der NPH2-Probe eine spontane α-syn-Aggregation beobachtet, bei NPH1 jedoch nicht, was deutlich bestätigt, dass die hemmende Wirkung von CSF auf die α-syn-Aggregation vom Spender abhängt. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse angesichts des für einige NPH-Patienten beschriebenen Verdünnungseffekts auf eine konzentrationsabhängige Hemmwirkung einiger Liquorbestandteile hin. Um diese Hypothese qualitativ zu testen, analysierten wir den Inhalt dieser beiden CSF-Proben mittels 1D-1H-Lösungs-Hochfeld-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR). Die offensichtlichsten Unterschiede zwischen den beiden Spektren lagen zwischen 1,5 und 0 ppm, wo normalerweise Methylresonanzen beobachtet werden (Abb. 3B). Interessanterweise scheinen einige Arten im Liquor von NPH1 im Vergleich zu NPH2 stärker konzentriert zu sein, was dem Muster der Hemmung der α-syn-Aggregation folgt. Aus metabolomischen Studien ist bekannt, dass fettsäurereiche Lipoproteine ​​und/oder andere HMW-Proteine ​​ähnlich breite Peaks in 1H-Lösungs-NMR-Spektren erzeugen [24, 25]. Die durch 1H-NMR erhaltenen qualitativen Informationen wurden dann durch nLC-nESI HRMS/MS bestätigt. Wir identifizierten etwa 400 bzw. 200 verschiedene Proteine ​​in NPH1 und NPH2. Albumin, Apolipoproteine ​​und Komplementproteine ​​waren die drei am häufigsten vorkommenden Proteinfamilien in reinen NPH1- und NPH2-CSF-Proben. Im NPH1-CSF war der Gesamtproteingehalt im Vergleich zum NPH2-CSF um den Faktor 2 (ein Faktor 3 für die gesamten Apolipoproteine) niedriger (siehe Abb. 3C).

Analyse von NPH-CSF-Proben. Ein Proteinaggregationstest, der unter Verwendung von 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS mit 40 µl CSF von 2 NPH-Probanden (40 µL) durchgeführt wurde. Die beiden ThT-Fluoreszenzspuren werden als durchschnittliche Intensität über 3 Wiederholungen dargestellt, wobei die Fehlerbalken das SEM darstellen. B Teil der 1D-1H-NMR-Spektren relativ zu den beiden NPH-CSF-Proben. C Relatives Konzentrationsverhältnis (emPAI-Score multipliziert mit Proteinmolekulargewicht) des Gesamtproteins und der drei am häufigsten vorkommenden Proteinbestandteile, gemessen durch nLC-nESI HRMS/MS in reinen NPH1- und NPH2-CSF-Proben. In NPH1 und NPH2 wurden etwa 200 bzw. 400 verschiedene Proteine ​​nachgewiesen. Albumin war das am häufigsten vorkommende Protein, gefolgt von Apolipoproteinen und Komplementproteinen. Die Apolipoprotein-Scores wurden summiert, wobei ApoA1 und ApoE am häufigsten vorkamen (~ 85 % der Gesamtzahl). Komplement C3 und C4 wurden als die am häufigsten vorkommenden Komplementproteine ​​gefunden (~ 65 % der Gesamtmenge).

Nachdem wir gezeigt hatten, dass die CSF-Zusammensetzung spenderabhängig ist und mit der Hemmung der α-syn-Aggregation in vitro korreliert, fraktionierten wir den zuvor verwendeten NC-CSF-Pool, um zu untersuchen, welche CSF-Komponenten hinter dieser hemmenden Wirkung standen. Die Fraktionierung wurde unter Verwendung konischer zentrifugaler Molekulargewichts-Cut-off-Filter (MWCO) durchgeführt (Einzelheiten zum Fraktionierungsverfahren und den Endkonzentrationsfaktoren finden Sie in Abb. 4A und Tabelle S1). Nach der Fraktionierung haben wir 6 Proben erhalten: vollständiger Liquor, Liquorbestandteile mit einem Molekulargewicht (MW) über 100 kDa (> 100 kDa), Liquorbestandteile mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 50 kDa (100–50 kDa), Liquorbestandteile mit einem Molekulargewicht zwischen 50 und 50 kDa 10 kDa (50-10 kDa), CSF-Bestandteile mit einem MW zwischen 10 und 3 kDa (10-3 kDa) und CSF-Bestandteile mit einem MW unter 3 kDa (< 3 kDa). Anschließend analysierten wir die hemmende Wirkung jeder dieser 6 Fraktionen auf die spontane Aggregation von α-syn unter den zuvor erwähnten PBS-Bedingungen (dh denen von Abb. 2B, C, E). Abhängig vom Molekulargewicht der CSF-Fraktion gab es deutliche Unterschiede in der α-syn-Aggregation. Der gesamte CSF und alle Fraktionen mit einem MW > 10 kDa hemmten die α-syn-Aggregation drastisch, während Fraktionen mit 10-3 kDa und < 3 kDa eine vergleichbare Aggregation wie die Reaktion ohne CSF-Komponenten (PBS-Kontrolle) zeigten (Abb. 4B). Wir haben das zweite Fluoreszenzplateau (A2) mithilfe des Doppel-Sigmoidal-Modells geschätzt und die Ergebnisse mit den maximalen Fluoreszenzwerten (Fmax) für alle 6 CSF-abgeleiteten Proben verglichen (Abb. 4C). Wie erwartet waren A2 und Fmax innerhalb jeder CSF-abgeleiteten Probe sehr ähnlich, was die Güte der Anpassung bestätigt, mit Ausnahme des gesamten CSF und > 100 kDa, für die eine Anpassung nicht möglich war. Tatsächlich blieben die Fluoreszenzwerte für den gesamten Liquor und > 100 kDa praktisch flach, was die Anpassung an das Doppel-Sigmoidal-Modell erschwerte. Was auf eine geringere Hemmung der α-syn-Aggregation hindeutet, waren A2 und Fmax sowohl in Fraktionen mit 10–3 als auch mit < 3 kDa wesentlich höher, was mit der PBS-Kontrolle vergleichbar war. In der < 3 kDa-Fraktion wurde eine gewisse Hemmung beobachtet, aber dies ist wahrscheinlich das Ergebnis eines Anstiegs des pH-Werts durch Lufteinwirkung während des Fraktionierungsverfahrens und nicht einer Hemmung der α-syn-Aggregation durch Proteinkomponenten (wie in den NMR-Experimenten mit ergänzenden Materiallösungen beschrieben). zu Liquorfraktionen und Abb. S4-5). A2 und Fmax fielen bei Fraktionen von 50–10 und 100–50 kDa signifikant ab, was mit einem höheren Grad der Hemmung der α-syn-Aggregation vereinbar ist, während Gesamt-CSF und > 100 kDa am stärksten hemmend wirkten (Abb. 4C). Schätzungen von t2 zeigen ähnliche Ergebnisse, wobei der gesamte Liquor und > 100 kDa die Aggregation deutlich verlangsamen (Ergänzungsmaterial Abb. S6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wichtigsten Hemmkomponenten des Liquor in der > 100 kDa-Fraktion angereichert sind, die die gleiche Hemmwirkung wie der gesamte Liquor beibehält. Um Proteinkandidaten zu identifizieren, die für die Hemmung der α-syn-Aggregation verantwortlich sind, analysierten wir die aus CSF gewonnenen Proben mittels nLC-nESI HRMS/MS (Abb. 4D). Wir konnten mit nLC-nESI HRMS/MS keine relevanten Mengen an Proteinen in den Fraktionen 10–3 kDa und < 3 kDa nachweisen (nur sehr geringe Mengen an Albumin oder Albuminfragmenten in der Fraktion 10–3 kDa, siehe Ergänzungsmaterial, Tabelle S2). ). Im gesamten Liquor waren die am häufigsten vorkommenden der etwa 300 nachgewiesenen Proteine ​​Albumin, Transthyretin (TTR), Apolipoproteine ​​und Prostaglandin-D-Synthase (PGDS, auch bekannt als β-Spurenprotein). Albumin und PGDS waren in der > 100 kDa-Fraktion nicht besonders angereichert, was auf eine geringe Hemmwirkung dieser beiden Proteine ​​auf die α-syn-Aggregation schließen lässt. Aufgrund der hemmenden Wirkung auf die α-syn-Aggregation waren Apolipoproteine ​​im gesamten Liquor und in der > 100 kDa-Fraktion häufiger anzutreffen. ApoA1 und ApoE waren die am häufigsten vorkommenden Apolipoproteine ​​in der > 100 kDa-Fraktion (~ 80 %), während ApoJ und ApoD jeweils ~ 6 % ausmachten. Die höhere Häufigkeit von fettsäurereichen Lipoproteinen und/oder anderen HMW-Proteinen in NPH1 im Vergleich zu NPH2 sowie die hohe Häufigkeit von Lipoproteinen in der hemmendsten Fraktion des Liquor (> 100 kDa) legen nahe, dass diese Verbindungen im Liquor der Haupttreiber sein könnten die Hemmung der geimpften und spontanen Aggregation von α-syn.

Verschiedene CSF-Fraktionen wirken sich unterschiedlich auf die α-syn-Aggregation aus. Ein Schema des CSF-Fraktionierungsverfahrens. Aus einem Ausgangsaliquot von 4,5 ml CSF in PBS 1x haben wir 6 Aliquots mit Verbindungen unterschiedlichen Molekulargewichts gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach jeder Filtration mit Zentrifugalfiltern wurde der Durchfluss der filtrierten Fraktion zu einem Filter mit kleinerem Cut-off geleitet. B Die Zugabe von CSF-Fraktionen, dem gesamten NC-CSF-Pool und PBS (40 μl) wurde mit einem ThT-Proteinaggregationstest analysiert, um die Auswirkungen auf die spontane α-syn-Aggregation zu bewerten. Das Hintergrundsignal wurde durch Subtrahieren der durchschnittlichen Fluoreszenz von drei Replikaten korrigiert, die PBS, ganze CSF- und CSF-Fraktionen ohne α-syn enthielten. Alle ThT-Fluoreszenzspuren werden als durchschnittliche Intensität über 3 Replikate dargestellt, wobei die Fehlerbalken das SEM darstellen. C Mittelwert der angepassten A2-Parameter (die Anpassung war für Proben mit gesamtem Liquor und der > 100 kDa-Fraktion nicht möglich) und maximale Fluoreszenzwerte (Fmax), geschätzt aus einzelnen ThT-Spuren. Um die Ergebnisse besser vergleichen zu können, wurden zwei Fluoreszenzintensitätsskalen verwendet. Die dargestellten Werte entsprechen dem Durchschnitt von drei Wiederholungen, wobei die Fehlerbalken das SEM widerspiegeln. D Relative Konzentration (emPAI-Score multipliziert mit Proteinmolekulargewicht) der am häufigsten vorkommenden Proteinbestandteile, gemessen durch nLC-nESI HRMS/MS. Die Apolipoprotein-Scores wurden summiert, wobei ApoA1 und ApoE am häufigsten vorkamen (~ 85 % der Gesamtzahl). Die Werte für die Fraktionen 10–3 und < 3 kDa werden nicht angezeigt, da der Proteingehalt dieser Fraktionen im Vergleich zu den anderen vernachlässigbar war

Nachdem wir Lipoproteine ​​als Hauptkandidaten zur Erklärung der hemmenden Wirkung von CSF auf die α-syn-Aggregation identifiziert hatten, untersuchten wir, ob die Wirkung reproduziert wird, wenn gereinigtes Lipoprotein in Abwesenheit der anderen CSF-Komponenten verwendet wird. Als Kontrolle verwendeten wir serumgereinigtes High-Density-Lipoprotein (HDL) (LP3, Millipore-Sigma) und serumgereinigtes menschliches Serumalbumin (HSA, A1653, Millipore-Sigma). Die Albuminspiegel waren zwischen den CSF-Fraktionen ziemlich ähnlich, und wir haben bereits gezeigt, dass HSA die α-syn-Aggregation bei Plasmakonzentrationen (43 mg/ml) nur teilweise reduziert [16]. Wir haben diese Proteine ​​bei 0,12 und 0,57 mg/ml für HDL und 0,3, 6,7 und 43 mg/ml für HSA getestet (Abb. 5A). Wie erwartet zeigte die spontane Aggregation von α-syn in alleinigem Puffer das doppelte sigmoidale Verhalten und erreichte hohe Fluoreszenzwerte, während HSA selbst bei der höchsten Konzentration (Plasmaspiegel) eine geringfügige Hemmwirkung zeigte. Niedrigere Konzentrationen hatten keinen hemmenden Effekt auf die α-syn-Aggregation. Im Fall von HDL gab es eine auffällige hemmende Wirkung auf die α-syn-Aggregation. Darüber hinaus war diese Hemmung dosisabhängig, da es bei 0,12 mg/ml HDL zu einem geringfügigen Anstieg der Fluoreszenz und bei Verwendung von 0,57 mg/ml HDL zu einem völligen Fehlen der Aggregation kam. Die Auswertung von Fmax und A2 ergab eine Übereinstimmung zwischen beiden Parametern, mit Ausnahme von HDL, da die fehlende Aggregation die Anpassung des Doppel-Sigmoidal-Modells nicht zuließ (Abb. 5B). Die Analyse von A2/Fmax für niedrige HSA-Konzentrationen zeigte keine hemmende Wirkung auf die α-syn-Aggregation (Abb. 5B). Als komplementärer/orthogonaler Ansatz führten wir eine Dot-Blot-Analyse der Reaktionsprodukte unter Verwendung von A11- und OC-Konformationsantikörpern durch, die oligomere amorphe bzw. fibrilläre Aggregate erkennen [22]. Wie im invertierten und auf Fensterebene angepassten Bild mit OC- und A11-Antikörpern gezeigt (natives Bild und Zeitverlauf von α-syn-Proben allein sind im Ergänzungsmaterial Abb. S7 dargestellt), kam es zur Bildung von α-syn-Aggregaten (Proben). 1, 2 und 3) in Gegenwart aller getesteten HSA-Konzentrationen (Abb. 5C). Allerdings reduzierte HDL die Menge an α-syn-Aggregaten sowohl bei Konzentrationen von 0,12 als auch 0,57 mg/ml (Proben 4 und 5) deutlich, was die hemmende Wirkung von HDL auf die α-syn-Aggregation bestätigt. Wir haben auch Reaktionen ohne α-syn mittels Dot-Blot ausgewertet, um zu bestätigen, dass die Antikörpersignale kein Artefakt der serumgereinigten Proteine ​​waren (Proben 6–10). Die Quantifizierung des Dot-Blot-Signals zeigte deutlich geringere Mengen an α-syn-Aggregaten in Reaktionen, die HDL im Vergleich zu HSA enthielten (p < 0,001, Abb. 5D).

HDL reduziert die α-syn-Aggregation effizienter als HSA. Ein ThT-Proteinaggregationstest, der unter Verwendung von 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS, pH 7,4, in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von HSA (0, 0,3, 6,7 und 43 mg/ml) und HDL (0, 0,12 und 0,57 mg/ml) durchgeführt wurde. ml). Um die Hintergrundfluoreszenz zu entfernen, wurde vor der Analyse die durchschnittliche Fluoreszenz von drei Replikaten abgezogen, die die gleiche Menge an HSA und HDL ohne α-syn enthielten. Die Daten stellen die durchschnittliche Fluoreszenz von drei Replikaten dar, wobei die Fehlerbalken das SEM darstellen. Dargestellt sind B Fmax und angepasste A2-Parameter, angepasst aus einzelnen Spuren und gemittelt aus den drei Wiederholungen. C Invertiertes und fenster-/pegelangepasstes Bild des Dot-Blot-Assays, der an den Endreaktionsprodukten von HSA- und HDL-haltigen Proben durchgeführt wurde. Dot-Blots wurden mit OC- (Nachweis von Fibrillen) und A11-Konformationsantikörpern (Nachweis von amorphen Oligomeren) untersucht. D Angepasste (vom Hintergrund abgezogene) integrierte Dichte, gemessen in einem kreisförmigen Bereich von Interesse (0,35 cm2), der die Punkte umgibt, relativ zu den Proben 1–5, wobei Fehlerbalken die Standardabweichung des Hintergrundrauschens darstellen. Der durchschnittliche Grauwert ist für Proben mit HDL im Vergleich zu allen HSA-Konzentrationen, die durch Anwendung des zweiseitigen Student-t-Tests sowohl für OC- als auch für A11-Antikörper getestet wurden, deutlich niedriger (p < 0,001).

Nachdem wir bestätigt hatten, dass gereinigtes HDL in Plasmakonzentration die Hemmung der α-syn-Aggregation, die durch den gesamten Liquor und durch die > 100 kDa-Liquorfraktion gezeigt wird, reproduziert, haben wir bewertet, ob HDL das gleiche Hemmniveau beibehalten kann, wenn es in einem Konzentrationsbereich von 1 bis getestet wird 0,003 mg/ml (einschließlich der physiologischen Werte des menschlichen Liquor). Interessanterweise beobachteten wir eine dosisabhängige teilweise Hemmung der α-syn-Aggregation bei Zugabe von 0,003 und 0,03 mg/ml, während 0,3 und 1 mg/ml die Bildung ThT-reaktiver aggregierter Spezies vollständig blockierten (Abb. 6A). Die teilweise Hemmung machte sich am deutlichsten als Verzögerung des zweiten Wendepunkts (t2) bemerkbar, obwohl sie auch als Verringerung der Fluoreszenz des ersten Plateaus (A1) beobachtet wurde (Abb. 6A-Einschub). ApoE und ApoA1 machen 50–60 % des gesamten Liquor-Apolipoproteins aus, und ihre jeweilige berichtete Konzentration im Liquor beträgt etwa 0,01 mg/ml bzw. 0,004 mg/ml [26]. Unter Berücksichtigung der physiologischen HDL-Konzentration im Liquor von 0,03 mg/ml zeigen unsere Ergebnisse, dass HDL die α-syn-Aggregation bei einer physiologischen Konzentration und bei einer zehnfach niedrigeren Konzentration teilweise hemmte. Obwohl unsere Experimente mit hochgereinigtem rekombinantem α-syn durchgeführt wurden und gezeigt wurde, dass andere Komponenten keine nachweisbaren ThT-, OC- oder A11-Aggregate bilden, verwendeten wir WB zum Nachweis von monomerem rekombinantem α-syn als sekundäre Auslesung für dieses Experiment. In Übereinstimmung mit den ThT-Messwerten kam es in Abwesenheit von HDL zum Zeitpunkt des ersten Plateaus (48 Stunden) zu einer Abnahme des Monomer-α-syn, und zum Zeitpunkt des zweiten Plateaus (180 Stunden) war der größte Teil des Monomers verbraucht. (Abb. 6B, Zusatzmaterial Abb. S8A). Allerdings konnten wir nach 180 Stunden der Reaktion in Gegenwart von HDL monomeres α-syn nachweisen, wobei festgestellt wurde, dass das Monomersignal bei steigenden HDL-Konzentrationen zunahm (am höchsten bei 1 mg/ml HDL und am niedrigsten in Abwesenheit von HDL, Abb. 6C). Es ist jedoch erwähnenswert, dass wir in Gegenwart von 1 mg/ml HDL eine zusätzliche Bande (ca. 150–200 kDa) mit viel geringerer Intensität als die Monomerbande beobachteten (Ergänzungsmaterial Abb. S8B-C), was darauf hindeutet Hohe HDL-Konzentrationen haben möglicherweise einige präfibrilläre Oligomere stabilisiert und ihre Umwandlung in Fibrillen verhindert. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass gereinigtes Serum-HDL (in physiologischen Konzentrationen und ohne CSF-Milieu) ein wirksamer Inhibitor der α-syn-Aggregation ist, vergleichbar mit dem gesamten CSF und der CSF-Fraktion > 100 kDa.

HDL reduziert die α-syn-Aggregation selbst bei physiologischen (ca. 0,03 mg/ml) und subphysiologischen CSF-Werten, indem es die Bildung vorübergehender oligomerer/protofibrillärer Spezies verhindert. Ein Proteinaggregationstest, der unter Verwendung von 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS mit 0, 0,003, 0,03, 0,3 und 1 mg/ml zugesetztem Humanserum-HDL durchgeführt wurde. Um die Hintergrundfluoreszenz zu entfernen, wurde vor der Analyse die durchschnittliche Fluoreszenz von drei Replikaten abgezogen, die die gleichen Mengen an HDL ohne α-syn enthielten. Alle ThT-Fluoreszenzspuren werden als durchschnittliche Intensität über 3 Replikate dargestellt, wobei Fehlerbalken SEM darstellen. B Das Vorhandensein von monomerem α-syn (14–18 kDa) in Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten des spontanen Aggregationsprozesses gesammelt wurden, wurde durch WB unter Verwendung des Syn211-Antikörpers überwacht. Monomeres α-syn nimmt aufgrund der Bildung von Fibrillen mit zunehmender t ab. C Auf ähnliche Weise wurde ein WB mit Syn211 an den nach 180 Stunden erhaltenen Reaktionsprodukten bei unterschiedlichen HDL-Konzentrationen mit und ohne α-syn durchgeführt

Es wurde berichtet, dass CSF-HDL eine mittlere Größe zwischen Serum-HDL und Serum-Low-Density-Lipoprotein (LDL) aufweist [26,27,28], was die hemmende Wirkung von CSF-HDL modulieren könnte. Daher untersuchten wir auch die hemmende Wirkung von Serum-LDL (LP2, Sigma-Aldrich) auf die α-syn-Aggregation, um den Unterschied im MW zu kontrollieren. Wir haben auch TTR bewertet, da dieses Protein Unterschiede zwischen den verschiedenen CSF-Fraktionen aufwies. Unter den In-vitro-α-syn-Aggregationsbedingungen des in Abb. 6 zusammengefassten Experiments blockierte eine HDL-Konzentration über 0,03 mg/ml die spontane Aggregation von α-syn vollständig, was die Beobachtung der Feinheiten der Hemmwirkung erschwerte. Daher haben wir die Schüttelzeit verdoppelt (auf 2 Minuten), um die spontane Aggregation von α-syn in PBS weiter zu steigern. Unter diesen leicht veränderten Bedingungen beobachteten wir eine Aggregation von α-syn mit 0,3 mg/ml HDL. Es gab jedoch keine signifikante Verlängerungsphase, da die Fluoreszenz des ersten (A1) und zweiten (A2) Plateaus niedrig und sehr ähnlich war (Abb. 7A), was die hohe Hemmwirkung von HDL auf die spontane α-syn-Aggregation bestätigt. Unter den Bedingungen des 2-minütigen Schütteltests testeten wir LDL und TTR in denselben Konzentrationen, die zuvor für HDL getestet wurden, und bewerteten ihre Hemmwirkung anhand der aus den Fluoreszenzspuren extrahierten kinetischen Parameter (Abb. 7A-B). Überraschenderweise war LDL ein wirksamerer Inhibitor der spontanen α-syn-Aggregation als HDL, da 0,3 mg/ml LDL die Aggregation unter diesen Bedingungen vollständig blockierten (niedriger Fmax/A2 und > 200 h t2). TTR hemmte die spontane α-syn-Aggregation nicht, wenn es im physiologischen Konzentrationsbereich (0,03 und 0,3 mg/ml) getestet wurde (Abb. 7A-B). Dennoch zeigte TTR eine teilweise Hemmung, am deutlichsten bei Fmax/A2, wenn es mit 1 mg/ml getestet wurde, was Berichten zufolge nahe der physiologischen Plasmakonzentration von TTR liegt [29]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Größe, Dichte oder der Lipidgehalt des Lipoproteins für die Hemmung der α-syn-Aggregation nicht entscheidend sind, obwohl diese Faktoren das Ausmaß der Hemmung der α-syn-Aggregation modulieren können.

HDL und LDL behindern die α-syn-Aggregation effizienter als TTR. Lipoproteine ​​üben ihre Antiaggregationseigenschaften durch die Verflechtung mit frühen protofibrillären/oligomeren Spezies aus. AB-angepasste kinetische Parameter eines Proteinaggregationstests, der mit 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS mit unterschiedlichen Konzentrationen von LDL, HDL und TTR durchgeführt wurde. Die durchschnittliche Fluoreszenz von drei Replikaten, die die gleichen Mengen an LDL, HDL und TTR ohne α-syn enthielten, wurde vor der Analyse subtrahiert. CH-TEM-Bilder relativ zu den Endprodukten, die mit (CD) α-syn allein (0,7 mg/ml), (E) LDL 0,3 mg/ml allein, (F) HDL 0,3 mg/ml allein und einer Kombination aus beiden α erhalten wurden -syn 0,7 mg/ml + LDL 0,3 mg/ml (G) oder HDL 0,3 mg/ml (H)

Wir haben die Hemmung der α-syn-Aggregation durch Lipoprotein durch ThT, den Nachweis oligomerer und amorpher Spezies durch Konformationsantikörper und die Messung von monomerem α-syn durch WB gezeigt, diese Techniken ermöglichen jedoch nicht die Beobachtung fibrillärer α-syn-Spezies in der Vorhandensein von Lipoprotein. Daher verwendeten wir Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um Endprodukte von Aggregationsreaktionen zu bewerten, die α-syn allein, α-syn mit LDL oder HDL sowie HDL und LDL ohne α-syn enthielten (Abb. 7C-H). In Übereinstimmung mit den ThT-Fluoreszenzspuren und den für diese Reaktionen gesammelten kinetischen Parametern gab es eine deutliche Abnahme der Menge an α-syn-Fibrillen bei Reaktionen mit LDL und HDL im Vergleich zur Reaktion mit α-syn allein. Interessanterweise waren die wenigen beobachteten kleinen α-syn-Fibrillen mit Lipoproteinen verflochten (Abb. 7G, H), was in der α-syn-Reaktion mit HDL (Abb. 7H) leicht zu erkennen ist. Ähnliche Strukturen, wenn auch mit weniger klarer Verflechtung, wurden durch gemeinsame Inkubation von α-syn mit NC-CSF beobachtet (Ergänzungsmaterial Abb. S9).

Um zu bestimmen, ob die hemmende Wirkung von Lipoproteinen auf die spontane α-syn-Aggregation auch die Aggregation von α-syn beeinflusst, die SAAs innewohnt, haben wir ein hochempfindliches und spezifisches diagnostisches α-syn-SAA verwendet, das α-syn-Keime direkt aus PD/ verstärken kann. DLB/MSA-Liquor zeigt keine spontane Aggregation mit gesundem Kontroll-Liquor (HC) [9, 19]. Wir ergänzten n = 4 PD-CSF- und n = 4 HC-CSF-SAA-Reaktionen, die im SAA durchweg positiv bzw. negativ getestet wurden, mit unterschiedlichen HDL- und LDL-Werten. Jede SAA-Reaktion enthält CSF, daher gingen wir davon aus, dass sie das 1-fache der physiologischen CSF-Konzentration dieser Proteine ​​tragen. Somit sind 1X-Reaktionen reine CSF-Reaktionen, während 2X- und 5X-Reaktionen mit den gereinigten Lipoproteinen ergänzt wurden, um das 2- bzw. 5-fache ihrer jeweiligen physiologischen CSF-Konzentration zu erreichen (Abb. 8). HDL hemmte teilweise die Amplifikation von PD-α-syn-Samen und verlangsamte die Amplifikationsreaktion. Die Zeit bis zum Erreichen der Fluoreszenzschwelle von 5000 au (TTT) war bei der mit 2X HDL ergänzten Reaktion im Durchschnitt um etwa 24 % länger (Abb. 8C). Diese Hemmung war dosisabhängig, da 5X HDL einen größeren Einfluss auf die Amplifikation von PD-α-syn-Samen hatte; da die TTT im Vergleich zu denen, die in reinen Proben gemessen wurden, im Durchschnitt um ~ 55 % anstieg. Noch wichtiger ist, dass 5X HDL zwei durchweg positive (+) PD-CSF-Proben (PD34 und PD47) in ein nicht schlüssiges (?) Ergebnis umwandeln konnte [19] (Abb. 8D). LDL folgte einem ähnlichen Muster wie HDL und verursachte bei steigender LDL-Konzentration eine zunehmend längere TTT. Bei 2X LDL änderte sich das SAA-Ergebnis von „+“ zu „?“ für eine PD-Probe (PD10), während sich bei 5X für zwei PD-Proben (PD34 und PD62) änderte. Wir untersuchten auch, ob HDL eine gewisse Kreuzreaktion hervorrufen und eine spontane Aggregation in HC-Proben induzieren könnte. Es gab jedoch keinen relevanten Anstieg der Fluoreszenz bei Reaktionen, die HDL oder LDL enthielten, im Vergleich zur Kontrollbedingung. Die Wirkung der Zugabe von 2X und 5X HSA und TTR wurde auch in einer HC-Probe (HC22) und in einer PD-Probe (PD47, Experimente zusammengefasst in der Ergänzungsmaterialtabelle S4) getestet. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen hemmten HSA und TTR die Amplifikation von PD-α-syn-Samen nicht signifikant und induzierten keine spontane Aggregation in der HC-Probe.

HDL und LDL modulieren die α-syn-Aggregation in SAAs erheblich. AB Repräsentative SAAs-Spuren wurden an einer reinen PD (PD47)-CSF-Probe und an einer reinen HC (HC22)-CSF-Probe (1 × physiologische Konzentration) durchgeführt und die gleichen Proben wurden mit 0,006 mg/ml (2 × physiologische Konzentration) und 0,024 mg/ml versetzt. ml (5 × physiologische Konzentration) HDL oder LDL. Die durchschnittlichen kinetischen Spuren mit Fehlerbalken, die das SEM darstellen, das für drei Replikate von Wells berechnet wurde, die CSF mit HDL und LDL enthielten, sind in den Feldern A bzw. B dargestellt. CD Durchschnittliche Time-to-Threshold-Werte (TTT), gemessen in allen PD-Proben. Die durchschnittliche TTT und SEM wurden unter der Annahme einer TTT von 125 Stunden (maximal beobachtete TTT) für Replikate berechnet, bei denen die Aggregation nicht als signifikant angesehen wurde (Fmax < 5000 au). Eine einfaktorielle ANOVA in Verbindung mit einem Tukey-Post-hoc-Test wurde angewendet, um die statistische Signifikanz der beobachteten relativen Unterschiede aller einzelnen gemessenen Spuren zwischen unverdünnt, 2 × HDL/LDL und 5 × HDL/LDL zu bewerten. Signifikante Unterschiede wurden mit * markiert, wobei *** einen p-Wert < < 0,001 anzeigt. D Zusammenfassung des endgültigen SAA-Ergebnisses für die analysierten PD- und HC-Proben. Das Ergebnis wurde wie folgt kategorisiert: positiv (+), wenn 3/3 Replikate durch den probabilistischen Algorithmus als positiv ermittelt wurden, nicht schlüssig (?), wenn 2/3 Replikate durch den probabilistischen Algorithmus als positiv ermittelt wurden, und negativ (-), wenn nur 1/3 ermittelt wurden oder 0/3 Replikate wurden durch den probabilistischen Algorithmus als positiv bestimmt

Um die Rolle von Lipoproteinen bei der patientenabhängigen CSF-Hemmung der α-syn-Aggregation weiter zu bestätigen, haben wir ApoA1 und ApoE aus einem neu hergestellten gepoolten CSF (siehe Materialien und Methoden, Abschnitte 2.3, 2.11 und ergänzende Abbildung S11) durch Immunpräzipitation abgereichert (IP). Anschließend analysierten wir die spontane α-syn-Aggregation in Gegenwart von immunabgereichertem CSF (IP CSF), CSF, der dem IP-Verfahren ohne Antikörper unterzogen wurde (IP CSF no Ab), und reinem CSF (reiner CSF) aus derselben gepoolten CSF-Probe. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abb. 9 zusammengefasst. Wie erwartet führte die Abreicherung der beiden am häufigsten vorkommenden CSF-Apolipoproteine ​​(IP-CSF) zu einer deutlich schnelleren spontanen α-syn-Aggregation im Vergleich zu IP-CSF ohne Ab und reinem CSF.

Experimente mit ApoA1- und ApoE-immungeschwächtem Liquor. Ein Proteinaggregationstest, der unter Verwendung von 0,7 mg/ml rekombinantem α-syn in PBS mit 40 μL von: ApoA1 und ApoE IP ausgesetztem CSF (IP CSF), IP ohne Antikörper (IP CSF no Ab) und reinem CSF unterzogen wurde zu verschiedenen Aliquots desselben NC-Pools. Um die Hintergrundfluoreszenz zu entfernen, wurde vor der Analyse die durchschnittliche Fluoreszenz von drei Replikaten abgezogen, die das gleiche Reaktionsgemisch ohne α-syn enthielten. Alle ThT-Fluoreszenzspuren werden als durchschnittliche Intensität über 3 Replikate dargestellt, wobei die Fehlerbalken das SEM darstellen. B Durchschnittliche t2-angepasste Parameter mit Fehlerbalken, die das SEM darstellen. Die P-Werte wurden durch Anwendung einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Post-hoc-Test berechnet

Schließlich haben wir die Konzentrationen der beiden am häufigsten vorkommenden CSF-Apolipoproteine ​​(ApoA1 und ApoE) in n = 31 SAA-negativen NC-CSF-Proben gemessen. Obwohl Albumin den größten Teil der gesamten CSF-Proteine ​​ausmacht, wurden auch Gesamtproteinmessungen berücksichtigt, da sowohl CSF-ApoA1 als auch Albumin aus dem peripheren Blut stammen [30] und wir erwarteten, dass ihre Werte stark korrelieren. Die NC-CSF-Proben wurden mit α-syn-Samen (20 fg) versetzt und erneut mit SAA getestet, um mögliche Korrelationen zwischen den Konzentrationen dieser Analyten und den kinetischen SAA-Parametern zu analysieren. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abb. 10 zusammengefasst. Nach der Zugabe von 20 fg α-syn-Samen wurden alle NC-CSF-Proben SAA-positiv getestet. In Anbetracht der Tatsache, dass SAA-Zeitvariablen (TTT und T50) theoretisch linear mit dem Logarithmus der α-syn-Samenmasse zusammenhängen sollten [12], haben wir es vorgezogen, Log2-transformierte Gesamtprotein-, ApoA1- und ApoE-Werte zur Berechnung der Korrelationskoeffizienten zu verwenden Führen Sie lineare Regressionen durch. Allerdings wurden ähnliche Ergebnisse gefunden, wenn keine Logarithmustransformation angewendet wurde. Wie aus der Korrelations-Heatmap in Abb. 10B hervorgeht, waren CSF-ApoA1 und CSF-Gesamtprotein stark korreliert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ApoA1, ApoE und Gesamtprotein signifikant mit SAA T50 und TTT korrelierten (r = 0,4–0,5, FDR-bereinigter p-Wert < 0,05). Interessanterweise war die Log2-transformierte Summe von ApoA1 und ApoE die Variable, die die höchste Korrelation mit T50 (r = 0,55) und TTT (r = 0,62) zeigte, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass Lipoproteine ​​im Allgemeinen die α-syn-Aggregation in SAAs modulieren können .

ApoA1, ApoE und der Gesamtproteingehalt im Liquor korrelieren signifikant mit den SAA-Zeitvariablen. Eine repräsentative SAA-ThT-Fluoreszenzkurve relativ zu Proben, die die kürzeste (NC1, TTT = 12,8 h), mittlere (NC2, TTT = 15,8 h) und längste (NC3, TTT = 20,3 h) TTT erzeugen, gemittelt über drei Replikate. Alle ThT-Fluoreszenzspuren werden als durchschnittliche Intensität über 3 Replikate dargestellt, wobei die Fehlerbalken das SEM darstellen. B Heatmap, die Korrelationen (Pearsons) zwischen kinetischen SAA-Parametern und Log2-transformiertem Liquor ApoA1, ApoE, ApoA1 + ApoE und Gesamtprotein zusammenfasst. Die hierarchische Clusterbildung wurde mithilfe des Ward-Verknüpfungskriteriums durchgeführt. CF-Streudiagramme mit Einzelheiten zu Pearsons Korrelationskoeffizienten und relativem p-Wert für TTT vs. Log2-transformierte CSF-Konzentrationen (ursprünglich in μg/ml) von ApoA1 (C), ApoE (D), Gesamtprotein (E) und ApoA1 + ApoE (F). Außerdem werden lineare Regressionslinien mit ihren 95 %-Konfidenzintervallen (gepunktete Linien) angezeigt

Über die Hemmung der spontanen und keimtötenden Fibrilisierung von α-syn durch menschlichen Liquor wurde in der neueren Literatur kurz berichtet, aber noch nicht charakterisiert [1, 11, 12, 13]. Angesichts der potenziellen Beeinträchtigung der CSF-bedingten Hemmung bei diagnostischen SAAs haben wir dieses Phänomen in einem Multi-Technik-Ansatz untersucht, einschließlich nLC-nESI HRMS/MS, Dot-Blot, ELISA, IP, WB, TEM, Lösungs-NMR, einem hochpräzisen Verfahren und standardisierte diagnostische SAA sowie verschiedene In-vitro-Aggregationsbedingungen zur Bewertung der spontanen Aggregation von α-syn. Wir erfuhren zunächst, dass die hemmende Wirkung von CSF spenderabhängig ist, was diesem Problem eine neue Ebene der Komplexität verlieh. Unter Verwendung von α-syn-Aggregationsbedingungen, die die hemmende Wirkung von CSF sowohl auf die spontane als auch auf die Keimaggregation bei physiologischem pH-Wert und physiologischer Ionenstärke verstärkten, fanden wir einen dramatischen Unterschied in der hemmenden Wirkung von CSF bei zwei NPH-Fällen. NMR- und MS-Studien zeigten, dass die NPH-Probe mit der stärksten Hemmwirkung höhere Protein- und Lipoproteinwerte aufwies. Nach der Fraktionierung eines Pools von menschlichem NC-CSF mithilfe von MWCO-Filtern bestätigten wir, dass HMW-Komponenten (> 100 kDa) die gleiche hemmende Wirkung auf die α-syn-Aggregation wie ganzer CSF beibehielten, während Fraktionen mit kleinerem MW weniger hemmend wirkten. Es sollte berücksichtigt werden, dass die Porengrößenverteilung von MWCO-Filtern es einem geringen Prozentsatz an HMW-Komponenten ermöglicht, den Filter in kleineren MW-Anteilen zu passieren. Dieses mögliche Austreten von HMW-Material in Fraktionen mit niedrigerem Molekulargewicht könnte die geringere, aber immer noch erkennbare Hemmwirkung erklären, die in diesen Fraktionen beobachtet wird. Mithilfe von MS identifizierten wir Albumin, TTR, PGDS und Apolipoproteine ​​als die am häufigsten vorkommenden HMW-Komponenten im verwendeten NC-CSF-Pool. Die Verteilung von Apolipoprotein in den CSF-Fraktionen korrelierte mit der Hemmung der α-syn-Aggregation jeder Fraktion, während dies bei Albumin, TTR und PGDS nicht der Fall war. Apolipoproteine, insbesondere ApoA1 (28,3 kDa) und ApoE (34 kDa), waren in der > 100 kDa-Fraktion am häufigsten vertreten. Angesichts des MW wurden diese Apolipoproteine ​​höchstwahrscheinlich in Lipoproteinen im Liquor zusammengebaut. Wir bestätigten dann, dass serumgereinigtes HDL in Abwesenheit von CSF-Milieu in der Lage war, die spontane α-syn-Aggregation zu hemmen. Darüber hinaus wurde die teilweise Hemmung bei der Bewertung von HDL bei subphysiologischen CSF-Konzentrationen beobachtet. Diese Ergebnisse wurden durch die Verfolgung der Aggregation mittels Dot-Blot mit zwei verschiedenen Konformationsantikörpern und WB-Nachweis des monomeren α-syn bestätigt, das bei der Aggregationsreaktion nicht in Fibrillen umgewandelt wurde. In diesen Experimenten blieben die meisten α-syn bei 1 mg/ml HDL zwar monomer, wir konnten jedoch das Vorhandensein einer Bande bei 150–200 kDa erkennen, was darauf hindeutet, dass hohe HDL-Konzentrationen einige präfibrilläre Oligomere stabilisiert und ihre Umwandlung in Fibrillen behindert haben könnten. Da Liquor-HDL größer als Blut-HDL und kleiner als Blut-LDL sind [27, 28], haben wir auch die hemmende Wirkung von serumgereinigtem LDL auf die α-syn-Aggregation untersucht und selbst bei subphysiologische Konzentrationen. Wir haben HDL und LDL in den gleichen Konzentrationen in mg/ml ausgewertet, aber aufgrund des geringeren Molekulargewichts von HDL war die molare Konzentration von HDL höher als die Konzentration von LDL in unseren α-syn-Aggregationsexperimenten. Daher könnte die stärkere Hemmwirkung von LDL darauf hindeuten, dass die Hemmung durch den Lipidanteil des Komplexes gesteuert wird, obwohl es viele Berichte gibt, die zeigen, dass Lipide die Aggregation von α-syn fördern [31].

Wir verwendeten TEM, um die Ultrastruktur der α-syn-Fibrillen in Gegenwart von HDL und LDL zu beobachten und stellten fest, dass beide Lipoproteine ​​mit den Fibrillen kolokalisieren, was auf eine direkte Wechselwirkung mit α-syn-Aggregaten schließen lässt. Obwohl sich Lösungs-NMR zuvor als geeignetes Werkzeug zur Identifizierung von Proteinen erwiesen hat, die mit monomerem α-syn interagieren [16, 32], konnten wir keine Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen HDL oder LDL mit monomerem rekombinantem α-syn finden. Die Hypothese einer Wechselwirkung zwischen HDL und oligomeren oder präfibrillären Spezies wäre mit diesen Ergebnissen vereinbar. Die α-syn-Aggregationsbedingungen in PBS zeigten ein eigenartiges doppelt-sigmoidales Verhalten. Die TEM-Analyse ergab, dass das erste Plateau an präfibrillären/oligomeren Spezies angereichert war und das zweite Plateau an Fibrillen angereichert war, was auch für andere amyloidogene Proteine ​​berichtet wurde [33]. HDL reduzierte in erster Linie die Bildung oligomerer/protofibrillärer Spezies im ersten Plateau, was die nachfolgende Bildung von α-syn-Fibrillen dosisabhängig ab subphysiologischen Konzentrationen verlangsamte oder vollständig blockierte. Umgekehrt führte die Abreicherung der beiden am häufigsten vorkommenden CSF-Apolipoproteine ​​(ApoA1 und ApoE) aus CSF zu einer schnelleren spontanen Aggregation von α-syn in PBS. Insgesamt stimmen diese Ergebnisse mit einer hemmenden Wirkung der CSF-Lipoproteine ​​auf die Bildung oligomerer Spezies überein, insbesondere in der Lag-Phase vor dem ersten Plateau.

Anschließend untersuchten wir die Wirkung von Lipoproteinen auf die Amplifikation von α-syn-Samen aus menschlichen PD-CSF-Proben in einem hochempfindlichen SAA. In diesen Experimenten wurden die Reaktionen mit HDL und LDL ergänzt, um CSF-Proben mit dem 2-fachen oder 5-fachen der physiologischen Konzentrationen von HDL und LDL nachzuahmen. Wir fanden heraus, dass sowohl HDL als auch LDL die kinetischen Parameter der Amplifikationsreaktion ab der 2-fachen Konzentration signifikant verändern können. Bei einer 2-fachen LDL-Konzentration änderte sich das SAA-Ergebnis einer von vier PD-Proben von positiv zu nicht schlüssig, während das Gleiche bei zwei von vier PD-Proben sowohl bei 5-fachem HDL als auch bei LDL der Fall war. Dennoch ist die Wahrscheinlichkeit, auf CSF-Proben zu stoßen, die derart hohe Mengen an Lipoproteinen enthalten, gering, was mit der beeindruckenden Sensitivität und Spezifität übereinstimmt, über die diagnostische SAAs regelmäßig berichten [4]. Allerdings könnte die Konzentration aller Lipoproteine ​​zusammen, zusätzlich zu anderen weniger hemmenden CSF-Komponenten, die 5 % der klinisch und pathologisch bestätigten PD/DLB-Fälle erklären, die bei SAA-Tests normalerweise negativ ausfallen. Wir haben auch gezeigt, dass in einer kleinen Kohorte von NC-CSF-Proben, die mit 20 fg α-syn-Samen versetzt waren, SAA T50 und TTT signifikant mit den CSF-ApoA1- und ApoE-Spiegeln und noch stärker mit deren Summe korrelierten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das CSF-Gesamtprotein, eine Messung, die für die meisten Patienten, die sich einer CSF-Analyse für eine diagnostische Aufarbeitung unterziehen, leicht verfügbar ist, stark mit den CSF-ApoA1-Spiegeln korreliert und mäßig mit den kinetischen T50- und TTT-Parametern korreliert. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass die Kinetik der α-syn-Seed-Amplifikation nicht nur eine Funktion der Masse der α-syn-Seeds oder des α-syn-„Stammes“ ist, sondern auch von der Gesamtzusammensetzung des CSF und insbesondere der Konzentration der Lipoproteine /Apolipoproteine. Unsere Ergebnisse können tiefgreifende Auswirkungen auf die Verwendung kinetischer Parameter in SAA-Assays zur Vorhersage des Krankheitsstatus, des Krankheitsverlaufs und der Krankheitsprognose haben, da wir gezeigt haben, dass die hemmende Wirkung von Liquor spenderabhängig ist. Es bleibt unbekannt, ob das Fortschreiten der Krankheit mit der Menge an Samen in einer CSF-Probe korreliert. Wenn dies jedoch der Fall ist, sind für die Schätzung der α-syn-Samenspiegel anhand kinetischer Parameter Modelle zur Kontrolle von CSF-Komponenten wie Apolipoproteinen oder Gesamtprotein als Ersatzmaß erforderlich . Tatsächlich sollten TTT und T50 in Abwesenheit von Matrixeffekten linear mit dem Logarithmus der aggregierten α-syn-Masse verknüpft sein [12]. Die Hinzufügung von CSF-Lipoprotein/Gesamtproteingehalt als Kovariate kann diese lineare Beziehung wiederherstellen und so die Quantifizierung der aggregierten α-syn-Masse ermöglichen. Zusätzlich zu unseren Ergebnissen wurde bereits gezeigt, dass α-syn-Spezies und Lipoproteine ​​durch Co-Immunpräzipitation sowohl im Plasma [34] als auch im Liquor [35] interagieren. Angesichts der Tatsache, dass Apolipoproteinspiegel und Genotyp zuvor als relevant für Parkinson dokumentiert wurden (36, 37) und dass Lipoproteine ​​in unseren Experimenten die α-syn-Aggregation in vitro in subphysiologischen Konzentrationen hemmten, könnte die Wechselwirkung zwischen α-syn und Lipoproteinen biologisch relevant sein und verdient weitere Untersuchungen.

Unsere Ergebnisse beschreiben eine neuartige Wechselwirkung zwischen Lipoproteinen und α-syn, die die Bildung von α-syn-Fibrillen hemmt und relevante biologische Auswirkungen in vivo haben könnte. Unsere Ergebnisse haben auch direkte und wichtige Auswirkungen auf die zukünftige Entwicklung und Verbesserung von α-syn-SAAs, die derzeit das vielversprechendste Diagnoseinstrument für Synukleinopathien sind. Die hier beschriebene spenderspezifische Hemmung der CSF auf die α-syn-Aggregation bietet eine Erklärung für die fehlende Korrelation zwischen kinetischen Parametern und klinischem Verlauf. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass Apolipoprotein die wichtigsten hemmenden Komponenten von CSF ist, was darauf hindeutet, dass Messungen von Apolipoproteinen und/oder des Gesamtproteingehalts in Datenanalysemodelle integriert werden könnten, um störende Auswirkungen des CSF-Milieu auf die Quantifizierung von α-syn-Samen mithilfe kinetischer Parameter zu eliminieren.

Alle relevanten Daten, die während dieser Studie generiert oder analysiert wurden, sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Rohe Fluoreszenz- und Massenspektrometriedaten stehen den entsprechenden Autoren auf begründete Anfrage zur Verfügung.

Variationskoeffizient

Demenz mit Lewy-Körpern

Ethylendiamintetraessigsäure

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Exponentiell modifizierter PAI

Falscherkennungsrate

Maximale Fluoreszenz

Minimale Fluoreszenz

Gesunde Kontrolle

Lipoprotein mit hoher Dichte

Hohes Molekulargewicht

Humanserumalbumin

Heteronukleare Einzelquantenkorrelation

Affinitätschromatographie mit immobilisierten Metallionen

Immunpräzipitation

Isopropil-β-D-1-Tiogalattopiranosid

Luria–Landwirtschaft

Lipoprotein niedriger Dichte

Multisystematrophie

Molekulargewicht

Molekulargewichtsgrenze

Neurologische Kontrollen

NanoLiquidChromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie, ausgestattet mit einer Nanoelektrospray-Schnittstelle

Kernspinresonanz

Normaldruckhydrozephalus

Optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Parkinson-Krankheit

Prostaglandin-D-Synthase

Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure)

Zyklische Verstärkung der Proteinfehlfaltung

Phenylmethylsulfonylfluorid

Polyvinylidenfluorid

Relative Fluoreszenzeinheiten

Region von Interesse

Durch Erdbeben verursachte Konvertierung in Echtzeit

Samenamplifikationsassay

Natriumdodecylsulfat – PolyAcrylamid-Gelelektrophorese

Standardfehler des Mittelwerts

Zeit, das halbe Maximum zu erreichen

Transmissionselektronenmikroskopie

Thioflavin-T

Transthyretin

westlicher Fleck

α-Synuclein

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Wir danken Dr. Maya Petricciuolo für die Unterstützung bei der Vorbereitung der TEM-Gitter. Wir danken auch den anonymen Gutachtern für ihre konstruktive Kritik und Anregungen.

GB wird durch das Postdoctoral Fellowship for Basic Scientists-Stipendium der Parkinson-Stiftung unterstützt (Auszeichnungs-ID: PF-PRF-934916). SP wird durch den Zuschuss AGYR2020 der Associazione Italiana Ricerca Alzheimer Onlus (Airalzh) finanziert. Diese Arbeit wurde teilweise vom italienischen Gesundheitsministerium (RRC) an FM unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von der Regione Toscana (CERM-TT und BioEnable), dem italienischen Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca durch das „Progetto Dipartimenti di Eccellenza 2023–2027 (DICUS 2.0)“ an die Fakultät für Chemie unterstützt. Ugo Schiff“ von der Universität Florenz und das JOYNLAB-Labor für rekombinante Proteine. Die Autoren würdigen die Unterstützung und Nutzung der Ressourcen von Instruct-ERIC, einem wegweisenden ESFRI-Projekt, und insbesondere dem italienischen Zentrum CERM/CIRMMP sowie dem Projekt „Potentiating the Italian Capacity for Structural Biology Services in Instruct-ERIC, Akronym“. ITACA.SB“ (Projekt-Nr. IR0000009) im Rahmen der Ausschreibung MUR 3264/2021 PNRR M4/C2/L3.1.1, gefördert durch die Europäische Union – NextGenerationEU. ALW wird durch die Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 86019 – MIRIADE-Projekt (Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union) unterstützt.

Labor für klinische Neurochemie, Abteilung für Neurologie, Abteilung für Medizin und Chirurgie, Universität Perugia, Piazzale Lucio Severi 1/8, 06132, Perugia, Italien

Giovanni Bellomo, Silvia Paciotti, Anna Lidia Wojdaƚa, Marta Filidei und Lucilla Parnetti

Forschungs- und Entwicklungseinheit, Amprion Inc, 11095 Flintcote Av., San Diego, San Diego, CA, 92121, USA

Luis Concha-Marambio, Yihua Ma und Carly M. Farris

Magnetic Resonance Center (CERM), Universität Florenz, Via Luigi Sacconi 6, 50019, Sesto Fiorentino, Italien

Domenico Rizzo, Linda Cerofolini, Stefano Giuntini, Sara Bologna, Enrico Ravera, Moreno Lelli, Marco Fragai und Claudio Luchinat

Fakultät für Chemie „Ugo Schiff“, Universität Florenz, Via Della Lastruccia 3, 50019, Sesto Fiorentino, Italien

Domenico Rizzo, Enrico Ravera, Moreno Lelli, Marco Fragai und Claudio Luchinat

Abteilung für Physiologie und Biochemie, Abteilung für Medizin und Chirurgie, Universität Perugia, Piazzale Lucio Severi 1/8, 06132, PerugiaPerugia, Italien

Davide Chiasserini & Leonardo Gatticchi

Interuniversitäres Konsortium für Metallprotein-Magnetresonanzen (CIRMMP), Via Luigi Sacconi 6, 50019, Sesto Fiorentino, Italien

Linda Cerofolini, Enrico Ravera, Moreno Lelli, Marco Fragai und Claudio Luchinat

Abteilung für Neurologie 5 und Neuropathologie, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta, Via Celoria 11, 20133, Mailand, Italien

Chiara Maria Giulia De Luca & Fabio Moda

Abteilung für Gesundheitswissenschaften, CISM-Massenspektrometriezentrum, Universität Florenz, Viale Gaetano Pieraccini 6, 50139, Florenz, Italien

Giuseppe Pieraccini

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GB, CL und M.Fr. entwarf die Forschung; GB, SP, LG, DR führten die Proteinaggregationstests durch, um die Wechselwirkung zwischen α-syn und CSF zu charakterisieren; LCM, YM und CMF planten und führten die Experimente zur ultraempfindlichen Samenamplifikation bei Amprion durch. DR und SB exprimierten und gereinigtes rekombinantes α-Synuclein; DR und SG exprimierten und gereinigtes rekombinantes Transthyretin; GB, LC, DR und ML führten Lösungs-NMR-Experimente durch; SG, DR und SP führten eine CSF-Zusammenlegung und -Fraktionierung durch; LG und SP führten Dot-Blot- und Western-Blot-Experimente durch; GP führte die massenspektrometrischen Analysen durch; FM und CMGDL führten die Transmissionselektronenmikroskopie-Messungen durch; ALW, DC und GB führten CSF-Immunpräzipitation, Western-Blot-Experimente, Gesamtproteingehalt und ELISA-ApoA1- und ApoE-Messungen durch; M.Fr., CL und LP stellten die benötigten Reagenzien und Analysewerkzeuge zur Verfügung; GB, ER und M.Fi. führte die Literaturrecherche durch; CL, LP, M.Fr. und ML überwachte das Projekt; GB analysierte die Daten und schrieb den ersten Entwurf; ER, YM und CMF, überarbeitete englische Sprache und Grammatik; Alle Autoren überprüften die endgültige Fassung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Giovanni Bellomo oder Claudio Luchinat.

Alle Eingriffe an menschlichen Probanden wurden gemäß der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Alle Patienten und/oder ihre gesetzlichen Vertreter gaben eine informierte schriftliche Einwilligung zur Lumbalpunktion, Liquorsammlung, Beurteilung, Analyse und Einbeziehung in die Studie, die von der örtlichen Ethikkommission (CEAS Nr. 1287/08) der Universität Perugia genehmigt wurde . Liquorproben wurden mit der Einverständniserklärung aller Teilnehmer entnommen.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden finanziellen Interessen: Prof. Parnetti war Mitglied von Beiräten für Fujirebio, IBL, Roche und Merck. Dr. Concha, Frau Farris und Herr Ma sind Erfinder mehrerer Patente im Zusammenhang mit der SAA-Technologie (PMCA) und mit Amprion Inc. verbunden, einem Biotech-Unternehmen, das sich auf die kommerzielle Nutzung von SAA für die Diagnose konzentriert. Alle anderen Autoren geben an, dass keine finanziellen und nichtfinanziellen Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Abb. S1. Silberfärbung von α-syn, verwendet in Proteinaggregationsexperimenten. Zwei wiederholte Silberfärbungsexperimente wurden auf einem 4–20 %igen SDS-PAGE-Gel mit 1 μg gereinigtem α-syn nach einem (Spur 3) und zwei (Spur 2) Größenausschlusschromatographieschritten durchgeführt. Abb. S2. T50 gemessen in sechs verschiedenen menschlichen CSF-Proben, versetzt mit 20 fg Samen. Die gemessenen T50-Parameter waren global unterschiedlich, wie durch eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und den LSD-Post-hoc-Test nach Fisher für Mittelwertvergleiche beurteilt wurde. *0,01 100 kDa CSF-Fraktion in PBS. Die Rückstände, bei denen die Signalintensität am stärksten abnimmt (um eine oder mehrere Standardabweichungen im Vergleich zum Durchschnittswert kleiner), sind hellblau hervorgehoben. Die Intensitätsverhältnisse, die überlappenden Peaks entsprechen, werden rot hervorgehoben (ihre Werte wurden bei der Berechnung der durchschnittlichen Abnahmen und Standardabweichungen nicht berücksichtigt). Abb. S5. Liquor-pH-Drift. Die pH-Änderung aufgrund der Luftexposition von CSF wurde über die Zeit in 500 μl unverdünntem gepooltem CSF (A) und in Gegenwart von PBS (400 μl CSF + 200 μl PBS 3x) in Polypropylenfläschchen mit einem Thermo Scientific Orion pH-Wert überwacht -Messgerät ausgestattet mit einer pHenomenal MIC 220 Micro-Mikroelektrode mit 6 mm Durchmesser. Unmittelbar vor jeder Messung wurde die Probe 20 Sekunden lang gevortext und weitere 20 Sekunden an der Luft gelassen. Abb. S6. Verschiedene CSF-Fraktionen wirken sich unterschiedlich auf die α-syn-Aggregation aus. Mittelwert der angepassten t2-Parameter von Proben mit 40 μl PBS/CSF-Fraktionen. Die angezeigten Werte ergeben sich aus dem Durchschnitt von drei Wiederholungen, wobei die Fehlerbalken das SEM widerspiegeln. Für den gesamten CSF und die >100-kDa-Fraktion wird die Gesamtdauer des Experiments angezeigt, da keine nennenswerte Aggregation vorliegt. Abb. S7. Rohbilder der Dot-Blot-Assays. AB) Native Bilder des Dot-Blot-Assays, der an α-syn-Replikationen allein zu verschiedenen Zeitpunkten mit OC- (A) und A11-Konformationsantikörpern (B) durchgeführt wurde. CD) Natives Bild des Dot-Blot-Assays, der an HSA- und HDL-haltigen Proben mit OC- (C) und A11- (D) Konformationsantikörpern durchgeführt wurde. Abb. S8. WB-Experimente zur Verfolgung der α-syn-Aggregation in Gegenwart von menschlichem HDL. A) α-Syn-Aggregationsmuster in Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten des spontanen Aggregationsprozesses gesammelt wurden, wurden durch WB unter Verwendung des Syn211-Antikörpers (4–20 % SDS-PAGE, 2 μg Protein beladen) überwacht. Monomeres α-syn nimmt aufgrund der Bildung von Fibrillen mit zunehmender t ab. B) Auf ähnliche Weise wurde ein WB mit Syn211 an den nach 180 h erhaltenen Reaktionsprodukten bei unterschiedlichen HDL-Konzentrationen mit und ohne α-syn durchgeführt (Belichtungszeit 210 s). C) Das Experiment wurde dann wiederholt, indem die in das Gel geladene Probenmenge verdoppelt wurde, um das Vorhandensein oligomerer Spezies besser hervorzuheben (Belichtungszeit 30 s). Unter diesen Bedingungen, die ausgewählt wurden, um das Signal bei 150–200 kDa besser sichtbar zu machen, spiegeln die α-syn-Monomerbanden bei 1 und 0,3 mg/ml HDL möglicherweise nicht quantitativ die Monomerkonzentration wider (überladene Spuren). Abb. S9. Repräsentative TEM-Bilder von α-syn, inkubiert mit CSF. Repräsentative TEM-Bilder, die durch die Analyse von Proben erhalten wurden, die durch Co-Inkubation von α-syn 0,7 mg/ml bei 37 °C mit gepooltem menschlichem CSF (Verhältnis 1:5 in Bezug auf das Gesamtreaktionsvolumen) erhalten wurden. Die Proben wurden Zyklen aus Inkubation (13 Min.) und Schütteln (Doppelorbital, 2 Min.) bei 500 U/min unterzogen. Abb. S10. NMR-Titrationen von α-syn mit HDL, LDL und TTR. A) Intensitätsabnahmen der Signale von zweidimensionalen (2D) 15N–1H-HSQC-Experimenten, aufgenommen bei 950 MHz bei T = 283 K an 15N-markiertem α-syn (100 μM) in PBS nach der Zugabe von 0,57 mg/ml Serum- abgeleitetes HDL. Die Intensitätsverhältnisse der überlappenden Peaks werden rot hervorgehoben. B) Intensitätsabnahmen der Signale von zweidimensionalen (2D) 15N–1H-HSQC-Experimenten, aufgenommen bei 950 MHz bei T = 283 K an 15N-markiertem α-syn (100 μM) in PBS nach der Zugabe von 1 mg/ml Serum- abgeleitetes LDL. C) Intensitätsabnahmen der Signale zweidimensionaler (2D) 15N–1H-HSQC-Experimente, aufgenommen bei 950 MHz und T = 283 K an 15N-markiertem α-syn (100 μM) in PBS nach Zugabe von 3 mg/ml TTR. Abb. S11. WB-Experimente wurden an immungeschwächtem CSF durchgeführt. WB-Experimente wurden mit Anti-ApoA1- (MIA1404) und Anti-ApoE-Antikörpern (PA5-27088) an reinem Liquor und Überständen (400 μl Liquor, 100 μl Aufschlämmung) durchgeführt, die aus einem Immunpräzipitationsverfahren mit unterschiedlichen Mengen derselben Antikörper (IP-Liquor) resultierten Proben), Immunpräzipitation ohne Antikörper (CSF IP no Ab). Anschließend wurden die Bedingungen für IP CSF ApoA1 60 µg und IP CSF ApoE 20 µg für Proteinaggregationstests ausgewählt. Tabelle S1. Konzentrationsfaktoren und Endvolumina der CSF-Fraktionen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bellomo, G., Paciotti, S., Concha-Marambio, L. et al. Lipoproteine ​​der Liquor cerebrospinalis hemmen die α-Synuclein-Aggregation durch Wechselwirkung mit oligomeren Spezies in Samenamplifikationstests. Mol Neurodegeneration 18, 20 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00613-8

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Eingegangen: 26. August 2022

Angenommen: 12. März 2023

Veröffentlicht: 01. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00613-8

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