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Ein Atlas der Substratspezifitäten für das menschliche Serin/Threonin-Kinom

Nature Band 613, Seiten 759–766 (2023)Diesen Artikel zitieren 67.000 Zugriffe 29 Zitate 433 Details zu altmetrischen Metriken Dieser Artikel wurde aktualisiert. Die Proteinphosphorylierung ist eine der am weitesten verbreiteten

Nature Band 613, Seiten 759–766 (2023)Diesen Artikel zitieren

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433 Altmetrisch

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Dieser Artikel wurde aktualisiert

Die Proteinphosphorylierung ist eine der am weitesten verbreiteten posttranslationalen Modifikationen in der Biologie1,2. Mit Fortschritten in der auf Massenspektrometrie basierenden Phosphoproteomik wurden bisher 90.000 Stellen der Serin- und Threoninphosphorylierung identifiziert und mehrere Tausend wurden mit menschlichen Krankheiten und biologischen Prozessen in Verbindung gebracht3,4. Für die überwiegende Mehrheit der Phosphorylierungsereignisse ist noch nicht bekannt, welche der mehr als 300 im menschlichen Genom kodierten Protein-Serin/Threonin-Kinasen (Ser/Thr) verantwortlich sind3. Hier haben wir synthetische Peptidbibliotheken verwendet, um die Substratsequenzspezifität von 303 Ser/Thr-Kinasen zu profilieren, die mehr als 84 % derjenigen ausmachen, von denen vorhergesagt wird, dass sie beim Menschen aktiv sind. Insgesamt gesehen war die Substratspezifität des Kinoms wesentlich vielfältiger als erwartet und wurde weitgehend durch negative Selektivität bestimmt. Wir haben unseren kinomweiten Datensatz verwendet, um die Kinasen, die in der Lage sind, jede gemeldete Phosphorylierungsstelle im menschlichen Ser/Thr-Phosphoproteom zu phosphorylieren, rechnerisch zu annotieren und zu identifizieren. Für die kleine Minderheit der Phosphosite, für die die mutmaßlich beteiligten Proteinkinasen zuvor beschrieben wurden, stimmten unsere Vorhersagen hervorragend überein. Als dieser Ansatz zur Untersuchung der Signalreaktion von Geweben und Zelllinien auf Hormone, Wachstumsfaktoren, gezielte Inhibitoren sowie umweltbedingte oder genetische Störungen angewendet wurde, ergaben sich unerwartete Erkenntnisse über die Komplexität und Kompensation der Signalwege. Insgesamt offenbaren diese Studien die intrinsische Substratspezifität des menschlichen Ser/Thr-Kinoms, beleuchten zelluläre Signalreaktionen und bieten eine Ressource, um Phosphorylierungsereignisse mit biologischen Signalwegen zu verknüpfen.

Die Phosphorylierung von Proteinen an Serin-, Threonin-, Tyrosin- und Histidinresten steuert nahezu jeden Aspekt der eukaryotischen Zellfunktion1,2,5,6. Eine Fehlregulation der Proteinkinase-Signalübertragung führt häufig zu Erkrankungen des Menschen7. Um die zellulären Rollen einer Proteinkinase zu entschlüsseln, müssen die nachgeschalteten Effektorsubstrate aufgeklärt werden. Die Mehrzahl der bisher veröffentlichten Kinase-Substrat-Beziehungen betrifft jedoch eine relativ kleine Anzahl gut untersuchter Proteinkinasen, während für die Mehrzahl der etwa 300 menschlichen Protein-Ser/Thr-Kinasen, wenn überhaupt, nur wenige Substrate identifiziert wurden innerhalb des menschlichen Kinoms8,9,10. Dieser Mangel an Kenntnissen über Kinase-Substrat-Beziehungen schränkt die Interpretation großer, auf Massenspektrometrie (MS) basierender Phosphoproteom-Datensätze ein, die bisher insgesamt über 200.000 Ser- und Thr-Phosphorylierungsstellen auf menschlichen Proteinen gemeldet haben3,4,11,12,13. Die spezifischen Kinasen, die für diese Phosphorylierungsereignisse verantwortlich sind, wurden für weniger als 4 % dieser Stellen beschrieben3, was das Verständnis zellulärer Phosphorylierungsnetzwerke erheblich einschränkt.

Es ist allgemein bekannt, dass gut untersuchte Ser/Thr-Kinasen spezifische Aminosäurereste an mehreren Positionen rund um die Phosphorylierungsstelle erkennen14,15,16,17. Dieses kurze lineare Motiv, das für eine bestimmte Proteinkinase charakteristisch ist, gewährleistet die Genauigkeit der Signalwege, die die Phosphorylierung an einem bestimmten Ser- oder Thr-Rest regulieren. Die Kenntnis der Kinase-Erkennungsmotive kann die Entdeckung neuer Substrate erleichtern, beispielsweise durch das Scannen von Phosphoproteomics-Daten nach passenden Sequenzen. Bisher sind Sequenzmotive der Phosphorylierungsstelle jedoch nur für eine Untergruppe des Ser/Thr-Kinoms des menschlichen Proteins bekannt. Wir haben zuvor kombinatorische Screening-Methoden für Peptidbibliotheken beschrieben, die die schnelle Bestimmung der Spezifität für einzelne Kinasen basierend auf der Phosphorylierung von Peptidsubstraten ermöglichen18,19. Hier wenden wir diese Methoden an, um experimentell die optimale Substratspezifität für den Großteil des menschlichen Ser/Thr-Kinoms zu bestimmen, die Beziehung zwischen Kinasen anhand ihrer Motive zu charakterisieren und diese Daten rechnerisch zu verwenden, um die Proteinkinasen zu identifizieren, die dies wahrscheinlich tun Phosphorylieren Sie alle mit MS oder anderen Techniken identifizierten Stellen. Abschließend zeigen wir, wie diese Informationen genutzt werden können, um komplexe Veränderungen in Signalwegen in Zellen und Geweben nach genetischen, pharmakologischen, metabolischen und umweltbedingten Störungen zu erfassen.

Substraterkennungsmotive im gesamten menschlichen Ser/Thr-Kinom wurden durch die Durchführung einer Positions-Scanning-Peptid-Array-Analyse (PSPA) bestimmt. Wir verwendeten eine zuvor beschriebene kombinatorische Peptidbibliothek, die jede der 22 Aminosäuren (20 natürliche Aminosäuren plus phosphoryliertes Thr und phosphoryliertes Tyr) systematisch an neun Positionen um eine zentrale Phospho-Akzeptorposition herum ersetzt, die äquivalente Mengen an Ser und Thr19 enthält (Abb. 1a). . Unter Verwendung gereinigter rekombinanter Kinasepräparate konnten wir erfolgreich Phosphorylierungsstellenmotive für 303 Ser/Thr-Kinasen erhalten, die jeden Zweig des menschlichen Ser/Thr-Kinase-Familienbaums sowie eine Sammlung atypischer Proteinkinasen abdecken (Abb. 1b, ergänzende Abb. 1). und Ergänzungstabellen 1 und 2). Für die große Mehrheit dieser Kinasen, darunter 83 wenig erforschte „dunkle“ Kinasen, fehlte eine Profilierung8.

a, Experimenteller Arbeitsablauf für die PSPA-Analyse und repräsentative Ergebnisse. Der Schaltplan wurde mit BioRender erstellt. Z bezeichnet feste Positionen, die eine der 20 natürlichen Aminosäuren oder entweder phosphoryliertes Thr (pThr) oder phosphoryliertes Tyr (pTyr) enthalten. X bezeichnet nicht fixierte Positionen, die randomisierte Mischungen aller natürlichen Aminosäuren außer Ser, Thr und Cys enthalten. Dunklere Flecken weisen auf bevorzugte Rückstände hin. b, Dendrogramm des menschlichen Proteinkinoms mit Hervorhebung der in dieser Studie analysierten Ser/Thr-Kinasen.

Aus quantifizierten PSPA-Daten abgeleitete positionsspezifische Bewertungsmatrizen (PSSMs) wurden durch hierarchisches Clustering analysiert, um Kinasesubstratmotive im gesamten Kinom zu vergleichen (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 2). Wie erwartet zeigten Kinasen mit weitgehender Sequenzidentität ein hohes Maß an Ähnlichkeit in ihren optimalen Substratmotiven. Wir fanden jedoch viele Fälle, in denen die Clusterbildung durch PSSM die aus ihren Primärsequenzen abgeleiteten evolutionären phylogenetischen Beziehungen zwischen Kinasen nicht genau wiedergab (Abb. 2). Stattdessen waren Mitglieder der meisten Hauptkinasegruppen über das Dendrogramm verteilt, was zahlreiche Beispiele widerspiegelt, in denen Kinasen mit geringer Gesamtsequenzidentität zusammengekommen sind, um ähnliche optimale Sequenzmotive zu phosphorylieren. Beispielsweise fanden wir heraus, dass eine Reihe entfernt verwandter Kinasen (in den YANK-, CK1- und 2-, GRK- und TGFβ-Rezeptorfamilien) trotz ihrer unterschiedlichen Positionen im Kinombaum zusammenkamen, um ähnliche Sequenzmotive zu phosphorylieren (Abb. 2 (Cluster 3)). .

Hierarchische Clusterbildung von 303 Ser/Thr-Kinasen auf Basis ihrer Aminosäuremotivselektivität (PSSMs). Kinasenamen sind entsprechend ihrer phylogenetischen Verwandtschaft farblich gekennzeichnet (oben rechts)2.

Eine Gesamtuntersuchung der Sequenzmotive, die mit verschiedenen Zweigen des motivbasierten Dendrogramms assoziiert sind, ergab, dass etwa 60 % des Ser/Thr-Kinoms durch einfache Zuordnung zu einer von drei zuvor beobachteten Motivklassen dargestellt werden könnten: Selektivität für basische Reste N-terminal zur Phosphorylierung Standort (Cluster 1; Abb. 2); gesteuert durch einen Prolinrest an der Position +1 (Cluster 2); oder eine allgemeine Präferenz für negativ geladene (saure und phosphorylierte) Reste an mehreren Positionen (Cluster 3)15,20,21. Bemerkenswert ist, dass mehr als die Hälfte aller von MS beobachteten Phosphorylierungsstellen einer dieser drei Signaturen zugeordnet werden konnten (Extended Data Abb. 1). Allerdings könnte jede dieser Motivklassen auf der Grundlage der Selektivität sowohl für als auch gegenüber bestimmten Sätzen von Resten an anderen Positionen weiter unterkategorisiert werden, was eine beträchtliche Diversität innerhalb dieser Cluster widerspiegelt (Extended Data Abb. 2–4). Die verbleibenden etwa 40 % des Ser/Thr-Kinoms bestanden aus vielen kleineren Gruppen, die einzigartige Sequenzdeterminanten aufwiesen (Abb. 2; Cluster 4–17). Beispielsweise gruppierten sich Motive für die Kinasen der PIKK-Familie (ATM, ATR, DNA-PK und SMG1) zu einer Gruppe, die hauptsächlich einen Gln-Rest an der Position +1 auswählte (Cluster 5), was mit früheren Studien übereinstimmt22,23. Bemerkenswerterweise zeigten mehrere Cluster gemeinsame Konsensmotive, die zuvor nicht gut erkannt wurden, wie beispielsweise die Gruppe, die die IRAK-, IRE-, WNK-, SNRK- und RIP-Kinasen (Cluster 13) umfasste, deren Substratmotive sowohl N- als auch C-terminale basische Reste enthielten zur Phosphorylierungsstelle mit dominanter Selektion für aromatische Reste an der Position +3. Als weiteres Beispiel erkannten die Kinasen LKB1, CAMKK, PINK1 und PBK (Cluster 14) hauptsächlich hydrophobe Reste N-terminal zur Phosphorylierungsstelle in Kombination mit der Selektion auf turn-fördernde Reste (Gly oder Asn) an der Position +1. Die Strukturmodellierung von Kinase-Peptid-Komplexen ergab komplementäre Merkmale innerhalb der katalytischen Kinasespalten, die wahrscheinlich für die Erkennung dieser Motive verantwortlich sind (Extended Data Abb. 5a, b).

Ein wichtiges und weniger allgemein anerkanntes Merkmal, das die Clusterbildung dominierte, war eine starke negative Selektion gegen positiv oder negativ geladene Reste an bestimmten Positionen innerhalb eines Motivs, was darauf hindeutet, dass die elektrostatische Filterung die Kinasesubstratauswahl im gesamten Kinom stark beeinflusst24. Wir haben zusätzliche Klassen von Aminosäuren identifiziert, wie zum Beispiel hydrophobe Reste, gegen die eine Vielzahl von Kinasen selektiert werden. Diese Trends legen nahe, dass die Substratvermeidung eine grundlegende Rolle bei der Bestimmung korrekter Kinase-Substrat-Wechselwirkungen spielt 25, 26.

Unerwarteterweise beobachteten wir, dass viele Kinasen (129 von 303) an mindestens einer Position innerhalb des Motivs entweder ein phosphoryliertes Thr oder ein phosphoryliertes Tyr als bevorzugte Aminosäure auswählten (ergänzende Abbildung 1; wobei eine Selektivität für phosphoryliertes Ser angenommen wurde). äquivalent zu phosphoryliertem Thr). Zusätzlich zu Kinasen, bei denen die Abhängigkeit vom Phospho-Priming bereits bekannt war (GSK3-, CK1- und CK2-Familien; Cluster 3), war dieses Phänomen besonders deutlich für die Kinasen der GRK- und YANK-Familie (Extended Data Abb. 4). von denen komplementäre basische Reste in ihren katalytischen Domänen aufweisen (Extended Data Abb. 5c, d). Bemerkenswerterweise zeigten einzelne Mitglieder der GRK-Familie eine einzigartige und spezifische Selektion hinsichtlich der Position des phosphorylierten Thr- oder phosphorylierten Tyr-Rests in ihren Substratpeptiden. GRKs sind vor allem für ihre Rolle bei der Desensibilisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bekannt, wobei die Multisite-Phosphorylierung die Bindung von Arrestin-Proteinen induziert, um die Signalübertragung zu hemmen27,28. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Fähigkeit von nur sieben GRKs, 800 verschiedene GPCRs unterschiedlich zu regulieren, wahrscheinlich ein komplexes Zusammenspiel zwischen der anfänglichen sequenzspezifischen Phospho-Primierung von GPCRs durch andere Ser/Thr- und Tyr-Kinasen, gefolgt von einer zweiten Ebene der Spezifität, die sich aus GRK ergibt, beinhaltet -abhängige Phosphorylierung und anschließende Erkennung durch eine kleine Anzahl von β-Arrestinen.

Merkmale von Substraterkennungsmotiven im gesamten Kinom konnten strukturell auf der Grundlage des Vorhandenseins spezifitätsbestimmender Reste an bestimmten Positionen innerhalb der katalytischen Kinasedomäne erklärt werden29,30,31,32, was sowohl zu erwarteten als auch zu unerwarteten Ergebnissen führte. Beispielsweise fanden wir heraus, dass die Hälfte der Kinasen ein gewisses Maß an Selektivität für entweder ein Ser oder ein Thr als Phospho-Akzeptor-Rest aufweist (Extended Data Abb. 6 und 7). In Übereinstimmung mit unseren zuvor veröffentlichten Beobachtungen33 korrelierte die Präferenz der Ser- oder Thr-Phospho-Akzeptorstelle stark mit der Identität des „DFG+1“-Rests (d. h. des Rests unmittelbar nach dem kanonischen Asp-Phe-Gly-Motiv innerhalb der Kinase-Aktivierungsschleife). , mit sperrigen Resten (Phe, Trp, Tyr) an dieser Position in Ser-selektiven Proteinkinasen und β-verzweigten Resten (Val, Ile, Thr) an dieser Position in Thr-selektiven Kinasen. Bei einigen DFG+1-Resten war die Selektivität von Ser gegenüber Thr jedoch unerwarteterweise kontextabhängig. Beispielsweise wurde ein Leu-Rest an der DFG+1-Position sowohl in Ser-selektiven als auch in Kinasen mit doppelter Spezifität beobachtet, wohingegen ein DFG+1-Ala-Rest im Zusammenhang mit einigen Kinasen (z. B. der) zu einer Präferenz für Thr-Phosphorylierung führte Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Kinasen (MAP3Ks)), aber eine Präferenz für Ser-Spezifität in anderen (den IκB-Kinasen). Diese Beobachtungen, die nur im Kontext des vollständigen Ser/Thr-Kinoms bemerkenswert sind, weisen darauf hin, dass zusätzliche Reste über die zuvor festgelegte DFG+1-Position hinaus die Ser/Thr-Spezifität kontextabhängig beeinflussen können.

Umfassendes Wissen über die Spezifität der menschlichen Ser/Thr-Kinase hat das Potenzial, die große Anzahl der gemeldeten Phosphorylierungsstellen ohne assoziierte Kinase zu „deorphanisieren“. Zu diesem Zweck haben wir eine kinomweite Annotation des menschlichen Ser/Thr-Phosphoproteoms erstellt, die einen zuvor kuratierten Satz von 82.735 Stellen umfasst, die mit MS4 mit hohem Durchsatz erkannt wurden, sowie weitere 7.017 Stellen, die nur mit Methoden mit niedrigem Durchsatz identifiziert wurden3. Unter Verwendung von Ansätzen, die aus zuvor veröffentlichten Forschungsergebnissen übernommen wurden, haben wir diese 89.752 Stellen rechnerisch für jedes Ser/Thr-Kinase-Motiv 34, 35 eingestuft (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 3). Bemerkenswert ist, dass etwa 99 % dieser Phosphorylierungsstellen für mindestens eine von uns profilierte Kinase positiv bewertet wurden (d. h. die Stelle erreichte für diese Kinase die besten 10 % aller Stellen im menschlichen Phosphoproteom). Diese Anmerkungen stimmten stark mit Stellen überein, für die zuvor beteiligte Proteinkinasen identifiziert wurden. Für Phosphorylierungsstellen, deren Upstream-Kinase zuvor durch mindestens drei unabhängige Berichte verifiziert wurde, die 969 Stellen und mehr als ein Drittel des Kinoms umfassen, ergab unser motivbasierter Ansatz ein mittleres Perzentil von 95 % (d. h. die gemeldete Stelle). eine höhere Punktzahl als 95 % aller mutmaßlichen Phosphorylierungsstellen im Phosphoproteom für seine etablierte Kinase) (Extended Data Abb. 8a). Als wir außerdem die Motive aller 303 profilierten Kinasen auf die in der Literatur angegebenen Phosphorylierungsstellen rückabbildeten, ergab unser Ansatz ein mittleres gemeldetes Kinase-Perzentil von 92 % (d. h. die gemeldete Kinase schnitt besser ab als 92 % aller profilierten Kinasen). in unserem Atlas für sein etabliertes Substrat) (Extended Data Abb. 9a). Diese Rangfolge verbesserte sich weiter, als wir Kinase-Substrat-Paare mit einer höheren Anzahl früherer Berichte betrachteten (Extended Data Abb. 8 und 9), was darauf hindeutet, dass in der großen Mehrheit der Fälle der lineare Sequenzkontext von Phosphorylierungsstellen wesentlich zur Kinase-Substrat-Paarung beiträgt Beziehungen.

a, Schematische Darstellung des Substratbewertungsprozesses4. b, Ergebnisse für Ser15 auf Glykogenphosphorylase neben PSSM und dem Substratmotivlogo seiner etablierten Kinase Glykogenphosphorylasekinase. c, Die Ergebnisse für Ser15 von p53 neben seiner etablierten Kinase ATM. d, Annotation des menschlichen Ser- und Thr-Phosphoproteoms durch Perzentilwerte von 303 Ser/Thr-Kinasen, durchgeführt wie in a gezeigt. Insgesamt 89.752 Phosphorylierungsstellen, die mithilfe von Hochdurchsatz-Ansätzen4 und/oder Niedrigdurchsatz-Ansätzen3 identifiziert wurden, wurden entlang der x-Achse nach der Anzahl der Kinasen mit Perzentilwerten über 90 sortiert. Auf der y-Achse waren die Kinase-Perzentilwerte für jeden Standort separat nach Rang sortiert und in der Heatmap dargestellt. Beispiele für gut untersuchte Kinase-Substrat-Beziehungen sind hervorgehoben (gelbe Quadrate). Einschub: Phosphorylierungsstellen am linken Ende des Diagramms schnitten für viele Kinasen positiv ab, während die Stellen am rechten Ende für weniger Kinasen positiv abschnitten.

Bemerkenswert ist, dass allein durch Motivvorhersagen zahlreiche prominent untersuchte Kinase-Substrat-Beziehungen erfolgreich identifiziert wurden. Beispielsweise erwiesen sich die Phosphorylasekinasen PHKG1 und PHKG2 als die beiden besten Treffer (von 303 Kinasen) für die Phosphorylierung von Ser15 der Glykogenphosphorylase (Abb. 3b). Dieses phosphorregulatorische Ereignis, das allererste, das entdeckt wurde36, eröffnete das gesamte Gebiet der phosphorylierungsabhängigen Signaltransduktion. Die bisher am häufigsten zitierte Kinase-Substrat-Wechselwirkung ist die Phosphorylierung des Tumorsuppressors p53 an Ser15 durch die durch DNA-Schäden aktivierte Kinase ATM, die zu den mit dieser Stelle assoziierten Kinasen mit dem höchsten Rang zählt (Abb. 3c). Bemerkenswert ist, dass andere Kinasen, von denen berichtet wurde, dass sie dieselbe Stelle phosphorylieren – ATR, SMG1 und DNAPK –, zu den vier am besten vorhergesagten Kinasen zählten3.

Unser Ansatz konnte auch Kinasen für Phosphorylierungsereignisse, die durch Substratkolokalisierung oder nichtkatalytische Docking-Wechselwirkungen gesteuert werden, korrekt identifizieren, wobei wir eine geringere Abhängigkeit von den Phosphorylierungsstellenmotiven ihrer Kinasen erwarteten. Beispielsweise haben wir sowohl die mitochondrial lokalisierte Phosphorylierung der Pyruvatdehydrogenase durch die Pyruvatdehydrogenasekinasen (Extended Data Abb. 10a) als auch die dockinggesteuerte Phosphorylierung der MAP-Kinase ERK durch MEK37 (Extended Data Abb. 10b) korrekt identifiziert. Bemerkenswert ist, dass die Phosphorylierungsstelle auf ERK von fast jeder menschlichen Proteinkinase, die wir profiliert haben, mit Ausnahme von MEK ausgewählt wurde, was erklärt, wie ERK ausschließlich durch MEK reguliert werden kann, während die Phosphorylierung durch das Kinom insgesamt vermieden wird. Schließlich könnte unser Ansatz Kinase-Unterfamilien mit ähnlichen Motiven auseinanderhalten und sie korrekt ihren etablierten Substraten zuordnen. Beispielsweise könnten wir zwischen den Kinasen der CDK-Familie, die klassische Rollen im Zellzyklusverlauf übernehmen (d. h. CDK1, CDK2, CDK3, CDK4 und CDK6), und der Untergruppe der CDKs, die die Gentranskription steuern (d. h. CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, CDK13 und CDK19)38,39 (Erweiterte Daten Abb. 11).

Durch die funktionelle Annotation des menschlichen Phosphoproteoms konnten wir globale Trends bei Kinase-Substrat-Wechselwirkungen untersuchen. Wir fanden heraus, dass die meisten Phosphorylierungsstellen einer kleinen Anzahl mutmaßlicher Kinasen zugeordnet werden konnten (BRAF-MEK1, ATM-p53 und CDK4-Rb; Abb. 3d und Ergänzungstabelle 3). Ungefähr einem Drittel aller Stellen fehlten jedoch eindeutige Merkmale zur Unterscheidung negativer Sequenzen und sie passten stattdessen gut zu den optimalen Phosphorylierungsmotiven für eine größere Anzahl von Kinasen21,40,41,42 (d. h. Ser119 von CREB, Ser9 von GSK3B). und Thr1079 von LATS1; Abb. 3d). Dies könnte auf die Bedeutung anderer Kinase-bestimmender Faktoren (Gerüste, Lokalisierung usw.) für die ordnungsgemäße Erkennung des Kinasesubstrats hinweisen oder darauf hinweisen, dass diese spezifischen Phosphorylierungsstellen Konvergenzpunkte für mehrere Signalwege sind. Beispielsweise wird das cAMP-Response-Element-Bindungsprotein (CREB) an Ser119 durch cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) kanonisch phosphoryliert; Zahlreiche frühere Berichte zeigen jedoch, dass ein breites Spektrum zellulärer Reize und Arzneimittelstörungen die Phosphorylierung dieser Stelle durch nicht weniger als zehn verschiedene Kinasen beeinflusst3. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass das Vorhandensein von Elementen mit negativer Selektivität, die eine mutmaßliche Phosphorylierungsstelle flankieren, dazu genutzt werden kann, ein Substrat vor unangemessener Phosphorylierung durch Dutzende verwandter Kinasen zu isolieren, wohingegen das Fehlen einer solchen negativen Selektivität Proteinkinasen auf unterschiedlichen Wegen dazu befähigen kann auf das gleiche Ziel konvergieren.

Zellsignalnetzwerke sind komplex und dynamisch. Eine Störung der Kinase-Signalwege durch genetische Manipulationen, Behandlung mit Wachstumsfaktoren und Liganden, Umweltstress oder niedermolekulare Inhibitoren verändert das Phosphoproteom durch direkte und indirekte Effekte als Folge sekundärer Signalreaktionen und/oder Off-Target-Effekte der experimentellen Behandlung43 . Aufgrund der vernetzten und dynamischen Natur von Phosphorylierungsnetzwerken ist die Unterscheidung zwischen anfänglichen Signalereignissen und solchen, die aus der anschließenden Aktivierung zusätzlicher Signalwege resultieren, ein häufiges und herausforderndes Problem. Wir kamen zu dem Schluss, dass Kinasen, die sowohl primären als auch sekundären Phosphorylierungsereignissen zugrunde liegen, möglicherweise durch eine globale motivbasierte Analyse von Veränderungen im entsprechenden Phosphoproteom aufgedeckt werden könnten. Um diese Idee zu testen, verwendeten wir öffentlich verfügbare MS-Datensätze von Zellen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Störungen gesammelt wurden, und bewerteten alle Phosphorylierungsstellen mit unserem Atlas der Ser/Thr-Kinase-Motive. Kinasemotive, die nach der experimentellen Behandlung signifikant angereichert oder abgereichert waren, wurden dann als Vulkandiagramme der Motivfrequenzen und angepassten P-Werte dargestellt (Abb. 4a).

a, Arbeitsablauf der Motivanreicherungsanalyse von Phosphoproteomics-Daten. Der Schaltplan wurde mit BioRender erstellt. b–g, Ergebnisse aus veröffentlichten Datensätzen. b: Konditioniertes Medium von HepG2-Zellen nach genetischer Deletion von FAM20C44. c, Kultivierte Myotubes nach 30-minütiger Behandlung mit 2 μM Isoproterenol45. d, HeLa-Zellen nach mitotischem Stillstand durch 45-minütige Behandlung mit 0,1 μM PLK1-Inhibitor BI 2536 (Lit. 46). e, A549-Zellen 2 Stunden nach Exposition gegenüber 6 Gy ionisierender Strahlung49. f, 3T3-L1-Adipozyten nach Serummangel und anschließender 1-minütiger und 60-minütiger Behandlung mit 100 nM Insulin54. g, aus dem Knochenmark der Maus stammende dendritische Zellen C57BL/6J nach 30-minütiger und 4-stündiger Behandlung mit 100 ng ml−1 Lipopolysaccharid (LPS)55. Die Anreicherungen in b–g wurden mithilfe einseitiger exakter Fisher-Tests bestimmt und mithilfe der Benjamini-Hochberg-Methode um mehrere Hypothesen korrigiert. Vollständig kommentierte Versionen dieser Diagramme sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.

Mit diesem Ansatz fanden wir heraus, dass Sequenzmotive, die dem direktesten Ziel einer genetischen oder chemischen Störung entsprechen, zu den am stärksten regulierten Motiven gehören, wie beispielsweise bei der genetischen Deletion der sekretierten primordialen Caseinkinase FAM20C zu sehen ist (Abb. 4b). . Als quantitative Phosphoproteomics-Daten von HepG2-Zellen ohne FAM20C44 mithilfe unseres kinomweiten Datensatzes analysiert wurden, entsprach das am stärksten herunterregulierte Kinase-Erkennungsmotiv dem von FAM20C. In ähnlicher Weise entsprachen die am stärksten hochregulierten Phosphorylierungsmotive mehreren Isoformen der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) – kanonischen Effektorkinasen stromabwärts der adrenergen Rezeptoren β1 und β2, wenn skelettmuskelähnliche Myotubezellen 30 Minuten lang mit Isoproterenol stimuliert wurden (Abb . 4c). Bemerkenswert ist, dass PKA-Motive denen mehrerer anderer basophiler Kinasen sehr ähnlich sind, wir konnten jedoch ihre Anreicherung in diesem Szenario identifizieren. Darüber hinaus hat unsere umfassende Ser/Thr-Kinom-Motivsammlung sekundäre Signalereignisse in einem Datensatz von HeLa-Zellen aufgeklärt, die unter Verwendung des PLK1-Inhibitors BI 2536 in der Mitose angehalten wurden (Abb. 4d)46; Hier beobachteten wir nicht nur eine deutliche Herunterregulierung von Substraten, die das optimale PLK1-Motiv enthielten, sondern auch eine Hochregulierung von durch ATM und ATR phosphorylierten Substraten. Dieser Befund stimmt gut mit früheren Berichten überein, dass PLK1 die Signalisierung von DNA-Schäden in mitotischen Zellen unterdrücken kann.

Unsere motivbasierte Analyse könnte auch verwendet werden, um wichtige Signalereignisse aufzudecken, die aus komplexeren Interventionen resultieren. Beispielsweise untersuchten wir phosphoproteomische Daten von A549-Zellen, die mit 6 Gy ionisierender Strahlung behandelt wurden (Abb. 4e). Unsere Analyse ergab die Hoch- und Herunterregulierung zahlreicher Signalwege, einschließlich der Hochregulierung kanonischer Kinasen, die an der DNA-Schadensreaktion beteiligt sind (ATM, ATR, DNA-PK), und der Herunterregulierung kanonischer Kinasen, die am Fortschreiten des Zellzyklus beteiligt sind (CDK1, CDK2, CDK4). und CDK6), was mit einem G1/S- und G2/M-Arrest übereinstimmt. Darüber hinaus fanden wir eine Hoch- und Herunterregulierung von weniger geschätzten, auf DNA-Schäden reagierenden Kinasen (MAPKAPK250,51, PLK352 und LRRK253).

Die vollständige Sammlung von Ser/Thr-Kinommotiven ermöglichte auch die Auflösung der zeitlichen Dynamik der Signalübertragung aus zeitaufgelösten phosphoproteomischen Datensätzen. Beispielsweise ergab eine motivbasierte Analyse der Phosphoproteomdaten von mit Insulin behandelten 3T3-L1-Adipozyten54 eine schnelle Aktivierung des Phosphoinositid-3-Kinase-Signalwegs innerhalb von 1 Minute nach der Insulinstimulation, gefolgt von einer anschließenden Aktivierung des MAPK-Signalwegs, zusammen mit einer Herunterregulierung von AMP- aktivierte Proteinkinasen innerhalb von 60 Minuten (Abb. 4f). In ähnlicher Weise deutete die Analyse phosphoproteomischer Daten von Lipopolysaccharid-stimulierten dendritischen Zellen55 auf eine deutliche Hochregulierung einer Reihe stressaktivierter Kinasen nach 30 Minuten hin, darunter IKKs, JNK und p38 MAPKs sowie die MAPKAPK-Familie von p38-Effektorkinasen. Darauf folgte innerhalb von 4 Stunden die anschließende Hochregulierung der PIM-Kinasen und die Unterdrückung der MAPKs parallel zur Herunterregulierung ihrer vorgelagerten MAPK3Ks (MEKK1, MEKK2 und ZAK)56, was auf eine negative Rückkopplungsschleife schließen lässt (Abb. 4g). Daher können umfassende motivbasierte Ansätze, wenn sie auf zeitaufgelöste Phosphoproteomics-Experimente angewendet werden, die unterschiedliche zeitliche Dynamik verschiedener Gruppen von Kinasen entschlüsseln.

Hier präsentieren wir das gesamte Spektrum der Substratmotive des menschlichen Serin/Threonin-Kinoms und bieten einen unvoreingenommenen, umfassenden Rahmen für die weitere Erforschung ihrer zellulären Funktionen. Insgesamt sind diese Motive wesentlich vielfältiger als erwartet, was auf ein breiteres Substratrepertoire des Kinoms schließen lässt. Durch die hierarchische Gruppierung dieses Datensatzes wurde das Kinom in mindestens 38 Motivklassen neu organisiert und mehrere gemeinsame Motivmerkmale eingeführt (Abb. 2 und erweiterte Daten, Abb. 2–4).

Die von uns profilierten Ser/Thr-Kinasen unterschieden fast ausnahmslos bestimmte Motivmerkmale stark. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Genauigkeit der Kinase-Signalwege größtenteils durch selektiven Druck auf Substrate erreicht wird, um die Phosphorylierung durch die Mehrzahl der irrelevanten Kinasen zu vermeiden, und dass dies durch die Abstimmung der Aminosäuresequenzen rund um die Phosphorylierungsstellen so erfolgen kann, dass sie von nicht verwandten Kinasen benachteiligt werden . Da diese negative Selektion wesentlich zur ordnungsgemäßen Substraterkennung beiträgt, erfordert die genaue Identifizierung von Kinase-Substrat-Beziehungen umfassende Kenntnisse der Kinase-Phosphorylierungsmotive – nicht nur für eine einzelne interessierende Kinase, sondern auch für alle anderen Kinasen im menschlichen Kinom, die möglicherweise konkurrieren derselbe Substratpool.

Als dieser kinomweite Datensatz verwendet wurde, um die spezifischen Kinasen, die für die Substratphosphorylierung verantwortlich sind, allein auf der Grundlage der Aminosäuresequenz rund um die Phosphorylierungsstelle vorherzusagen, waren die Ergebnisse bei der Identifizierung korrekter Kinase-Substrat-Beziehungen sehr genau, selbst ohne Kenntnis der Gewebespezifität , Gerüsteffekte oder subzelluläre Lokalisierung. Die Einbeziehung solcher zusätzlicher Informationen wird diese Vorhersageansätze wahrscheinlich weiter verbessern57,58. Eine Einschränkung bei der Verwendung von Peptidarrays erster Ordnung in diesen Experimenten besteht darin, dass sie die Beiträge interpositioneller Kontakte innerhalb der Substratpeptide nicht direkt messen, was, wie wir zuvor gezeigt haben, die Substratauswahl für einige Tyrosinkinasen beeinflussen kann32, wenn auch weniger für Ser/Thr Kinasen59. Darüber hinaus konnten wir nicht zwischen der Positionsauswahl von Ser- oder Thr-Resten und der direkten Phosphorylierung benachbarter Reste (z. B. Peptide, die mehr als einen Phospho-Akzeptor enthalten) unterscheiden. Strukturelle Modellierungsansätze, die auf Kinase-Substratmotivdaten basieren, werden möglicherweise diese zusätzlichen Informationen entschlüsseln, um die Vorhersagen weiter zu verbessern60,61.

Die Untersuchung von MS-Phosphoproteom-Datensätzen unter Verwendung dieser globalen Sammlung von Motiven lieferte potenzielle biologische Erkenntnisse und mutmaßliche Kinasesubstrate (Abb. 4). Beispielsweise wurde vorhergesagt, dass ATM in Zellen, die ionisierender Strahlung ausgesetzt sind (Abb. 4e), auf 37 der hochregulierten Phosphorylierungsstellen abzielt, von denen die meisten nie als Substrate für ATM in Verbindung gebracht wurden (Ergänzungstabelle 4). Während die Anwendung der Phosphoproteomik auf menschliche klinische Proben und Krankheitsmodellsysteme weiter voranschreitet, wird unser umfassender motivbasierter Ansatz in einzigartiger Weise in der Lage sein, die komplexe Signalübertragung zu entschlüsseln, die dem Krankheitsverlauf beim Menschen, den Mechanismen der Krebsmedikamentenresistenz, diätetischen Eingriffen und anderen wichtigen physiologischen Faktoren zugrunde liegt Prozesse. Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass dies eine wertvolle Ressource für ein breites Spektrum von Forschern sein wird, die Signalwege in der Humanbiologie und bei Krankheiten untersuchen.

Expi293-Zellen (Thermo Fisher Scientific) und HEK293T-Zellen (ATCC) wurden direkt von Anbietern bezogen, die eine kurze Tandem-Wiederholungs-Genotypisierung zur Authentifizierung menschlicher Zellen durchführen, und es wurde bestätigt, dass sie frei von Mykoplasmen sind. Sf9-Insektenzellen wurden von Thermo Fisher Scientific erhalten.

Zur Expression und Reinigung aus Bakterien wurden die unten aufgeführten DNA-Sequenzen für die menschlichen Ser/Thr-Kinasen, Bindungspartner und Chaperone mithilfe der GeneSmart-Vorhersagesoftware (GenScript) für die Expression in Escherichia coli codonoptimiert. Optimierte Kodierungssequenzen wurden als gBlocks (Integrated DNA Technologies) synthetisiert, die 16-bp-Überhänge an den 5'- und 3'-Enden tragen, um das In-Fusion-Klonen (Clontech) in pET-Expressionsvektoren (EMD Millipore) zu erleichtern.

pCDFDuet1-Konstrukte waren wie folgt: HSP90AA1-His6 (volle Länge), im Folgenden als „HSP90“ bezeichnet; HSP90 ohne Tag (volle Länge); His6-MO25a (volle Länge); His6-ALPHAK3/ALPK1 N-terminale Domäne (1–474); und His8-CCNC (volle Länge) zusammen mit MED12-His8 (1–100); ohne Tag MEK5/MAP2K5(S311D, T315D; volle Länge); und ohne Tag CK2B (volle Länge). pET28a-Konstrukte waren wie folgt: His6-PDPK1 (volle Länge); His6-PRP4/PRPF4B (519–Ende); GST-CAMK1A (volle Länge); GST-CHAK2/TRPM6(1699–Ende); His6-caMLCK/MYLK3(490–Ende); His6-CAMKK1 (124–411); His6-ERK7/MAPK15 (volle Länge); His6-SUMO-ALPHAK3/ALPK1 CTD(959–Ende); MYO3A-His6(1–308); ERK5/MAPK7-His6(1–405); His6-NIK/MAP3K14(327–673); und BMPR2-His6 (172–504). Die pETDuet1-Konstrukte waren wie folgt: His6-CDK8 (1–360, Fusion mit dem C-Schwanz von CDK19 (360–Ende)), His6-CDK19 (volle Länge); His6-AAK1(27–365); His6-BIKE(37–345); CK2A1-His6 (volle Länge); CK2A2-His6 (volle Länge); His10-MBP-MEKK1/MAP3K1 (1174–Ende); His6-CLK1(128–Ende); His8-PLK2(57–360); His10-MAP3K15(631–922); His6-SUMO-ASK1/MAP3K5 (659–951); und His6-TAO2(1–350). Das pACYDuet1-Konstrukt war wie folgt: CDC37 ohne Tag (volle Länge).

Für eine verbesserte Expression in Zellen von Säugetierlinien wurden die DNA-Sequenzen von His6-GST-SBK1 (volle Länge) und Flag-His6-WNK3 (1–434) mithilfe von GeneSmart (GenScript) für die Expression im Homo sapiens optimiert und als gBlocks (Integrated) synthetisiert DNA Technologies) mit 16-bp-Überhängen, um das Infusionsklonen in verdautes pCDNA3.4 (Thermo Fisher Scientific) zu erleichtern.

Um ein Säugetier-Expressionskonstrukt für TAK1/MAP3K7 zu erzeugen, wurden die kodierende Sequenz für diese Kinase (GE Healthcare Dharmacon, MHS6278-202756930) und ihr Bindungspartner TAB1 (GE Healthcare Dharmacon, MHS6278-202760135) PCR-amplifiziert und als Fusion ligiert Konstrukt (TAK1(1–303)-TAB1(451–Ende)) durch Infusion in den Säugetier-Expressionsvektor pLenti-X integrieren.

Die von anderen Labors oder Addgene gekauften oder erhaltenen Expressionskonstrukte waren wie folgt: Bakterielle Expressionskonstrukte für GST-VRK1 (volle Länge) und GST-VRK2 (volle Länge) in pGEX-4T wurden als Geschenke von P. Lazo62 erhalten. Das bakterielle Expressionskonstrukt für Maus-CDKL5-His6(1–352) in pET23a+ wurde als Geschenk von S. Katayama63 erhalten. Bakterielle Expressionskonstrukte für His6-SUMO-PDHK1 (volle Länge), His6-SUMO-PDHK4 (volle Länge), pGroESL (GroEL/GroES) und MBP-BCKDK (volle Länge) wurden als Geschenke von D. Chuang, S.- erhalten. C. Tso und R. Wynn64,65. pProEx HTa-BRAF_16mut V600E(444–721) war ein Geschenk von M. Therrien von der Université de Montréal66. Säugetierexpressionskonstrukte für Flag-ATR(S1333A) und HA-ATRIP wurden von D. Cortez67 bereitgestellt. Bakterielle Expressionskonstrukte für DMPK1, CAMK1G, CAMK2G, PHKG2, CDKL1, GAK und Lambda-Phosphatase wurden von Addgene (Addgene, 1000000094)68 erworben.

Sofern nicht anders angegeben, wurden Transformationen unter Verwendung von BL21-Sternzellen (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die verwendeten Antibiotikakonzentrationen waren wie folgt: Carbenicillin (100 mg l-1), Kanamycin (50 mg l-1), Spectinomycin (25 mg l-1) und Chloramphenicol (25 mg l-1 in Ethanol, frisch zubereitet). Transformierte Zellen wurden in 1 l Terrific Broth durch Schütteln bei 190 U/min und 37 °C gezüchtet, bis die optische Dichte (λ = 600 nm) 0,7–0,8 erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurde 1 mM IPTG zugegeben, um die Expression zu induzieren. Anschließend wurden die Zellen in einen gekühlten Schüttler überführt und 16–20 Stunden lang bei 220 U/min bei 18 °C geschüttelt. Die Zellen wurden bei 6.000 g zentrifugiert und die Pellets in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Alle Schritte zur Proteinreinigung wurden bei 4 °C durchgeführt. Zellpellets wurden in Lysepuffer (unten beschrieben) solubilisiert und durch Sondenbeschallung lysiert. Das Lysat wurde 1 Stunde lang bei 20.000 g zentrifugiert und der Überstand mit Affinitätsreinigungsharz, Nickel-NTA (Qiagen) oder Glutathion-Sepharose (GE Health) kombiniert, das in Basispuffer gespült worden war. Die überstehende Perlenaufschlämmung wurde 30 Minuten lang gerührt. Das Harz wurde mit 1 l Basispuffer gewaschen und in 10 Bettvolumina Elutionspuffer eluiert. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung der Ultra Centrifugal Filter Units (Amicon) konzentriert, mit 1 mM DTT und 25 % Glycerin ergänzt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Die Puffer waren wie folgt. Standard-Lysepuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin, HALT EDTA-freier Phosphatase- und Proteaseinhibitor-Cocktail (Life Technologies), 5 mM β-Mercaptoethanol und 1–3 g Lysozym (Sigma). -Aldrich). Standard-Basispuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin (50 mM Imidazol wurden für Reinigungen mit Polyhistidin-Tags hinzugefügt). Standardwaschpuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin (50 mM Imidazol wurden für Reinigungen mit Polyhistidin-Tags hinzugefügt). Polyhistidin-Tag-Elutionspuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin, 350 mM Imidazol. GST-Tag-Elutionspuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin, 10 mM Glutathion (der pH-Wert wurde nach Zugabe von Glutathion angepasst).

CDK8 wurde zusammen mit CCNC/MED12 gereinigt. CDK19 wurde zusammen mit CCNC/MED12 gereinigt. CK2A1 und CK2A2 wurden zusammen mit CK2B gereinigt. ERK5 wurde zusammen mit MEK5DD exprimiert. Die Kinasen BRAF und NIK wurden mit dem nicht markierten HSP90-CDC37-Komplex coexprimiert. Die N- und C-terminalen Domänen von ALPHAK3 wurden gemeinsam gereinigt. DMPK1, CAMK1G, CAMK2G, PHKG2, CDKL1 und GAK wurden zusammen mit Lambda-Phosphatase in Rosetta-2-Zellen (Novagen) exprimiert. PDHK1, PDHK4 und BCKDK wurden mit GroeL/GroeS coexprimiert und mit den folgenden Puffern gereinigt: Lysepuffer (100 mM Kaliumphosphat pH 7,5, 10 mM L-Arginin, 500 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 0,2 % Triton X-100, Lysozym), Waschpuffer (50 mM Kaliumphosphat pH 7,5, 10 mM Arginin, 500 mM NaCl, 0,1 % Triton KCl, 0,02 % Tween-20, 50 mM Arginin, 350 mM Imidazol für PDHK1 und PDHK4, 20 mM Maltose für BCKDK). BCKDK wurde über seinen MBP-Tag am Amyloseharz (NEB) gereinigt. CDKL5 wurde in BL21-codonplus(DE3)-RIL-Zellen exprimiert. KIS (volle Länge) wurde wie zuvor beschrieben gereinigt69.

Expi293F-Zellen (Thermo Fisher Scientific) wurden in 500 ml Expi293-Expressionsmedium (Thermo Fisher Scientific) in 2-l-Spinnerflaschen auf einer magnetischen Rührplattform bei 100 rcf bei 36,8 °C und 8 % CO2 kultiviert. Zur Transfektion wurden 500 μg Expressionskonstrukte in Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher Scientific) verdünnt. Das ExpiFectamine 293-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) wurde separat mit Opti-MEM verdünnt und dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit verdünnter Plasmid-DNA kombiniert. Anschließend wurde die Mischung auf die Zellen übertragen (3 × 106 Zellen pro ml) und gerührt. Dann wurden 20 Stunden nach der Transfektion den Zellen ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1 und Enhancer 2 (Thermo Fisher Scientific) zugesetzt. Zwei Tage später wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert (3 Tage nach der Transfektion).

Alle Schritte zur Proteinreinigung wurden bei 4 °C durchgeführt. Zellpellets wurden in Lysepuffer solubilisiert und durch Dounce-Homogenisierung (20 Hübe) lysiert. Das Lysat wurde 1 Stunde lang bei 100.000 g zentrifugiert und der Überstand wurde mit Affinitätsreinigungsharz, Nickel-NTA (Qiagen), Glutathion-Sepharose (GE Health) oder Anti-Flag-M2-Affinitätsgel (Sigma-Aldrich) kombiniert und 30 Minuten lang gerührt (Nickel- und Glutathionperlen) oder 1 Stunde (Anti-Flag-Perlen). Das Harz wurde mit 1 l Basispuffer gewaschen und in 10 Bettvolumina Elutionspuffer eluiert. Zur Elution von Flag-markierten Proteinen wurden die Perlen in Elutionspuffer (0,15 μg ml−1 3× Flag-Peptid (Sigma-Aldrich)) getaucht und vor der Elution 1 Stunde lang gerührt. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung von Ultra Centrifugal Filter Units (Amicon) konzentriert, mit 1 mM DTT und 25 % Glycerin ergänzt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Die Puffer waren wie folgt. Standard-Lysepuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 % Glycerin, 1 % Triton X-100, 5 mM β-Mercaptoethanol, HALT-Proteaseinhibitoren. Standard-Basispuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin. Standardwaschpuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin.

His6-GST-markiertes SBK wurde nacheinander auf Nickel- und dann auf Glutathionharzen gereinigt. Die Puffer waren wie folgt: der erste Waschpuffer: 25 mM Imidazol. SBK1-Elutionspuffer für Polyhistidin-Tag: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin, 250 mM Imidazol. SBK1-Elutionspuffer für GST-Tag: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin, 10 mM Glutathion. Flag-TAK1-TAB1-Elutionspuffer: 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Glycerin, 0,15 μg ml−1 3× Flag-Peptid.

Flag-His6-WNK3 wurde nacheinander auf Nickel- und dann auf Anti-Flag-Harzen gereinigt. Die Puffer waren wie folgt: der erste Waschpuffer: 25 mM Imidazol. Flag-Tag-Elutionspuffer (chloridfrei): 50 mM Tris pH 7,5, 2 mM Magnesiumacetat, 2 % Glycerin, 0,15 μg ml−1 3× Flag-Peptid.

Flag-ATR(S1333A) (350 μl) und HA-ATRIP (150 μg) wurden in Expi293-Zellen co-transfiziert und nach Zugabe von Enhancern einen weiteren Tag lang inkubiert (4 Tage nach der Transfektion). Die Puffer waren wie folgt. ATR-Lysepuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,25 % Tween-20, 2 mM MgCl2, DTT. ATR-Waschpuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,01 % Brij-35, 2 mM MgCl2, 5 mM ATP, DTT. ATR-Elutionspuffer: 20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,01 % Brij-35, DTT, 0,15 μg ml−1 3× Flag-Peptid.

Die Eluate wurden in 100-kDa-MWCO-Amicon-Röhrchen auf 1 ml konzentriert und mithilfe der MonoS-Säule in einem 0–1 M NaCl-Gradienten (Puffer: 25 mM Bis-Tris pH 6,9, 0,01 % Brij-35 und 5 mM TCEP) aufgelöst. Insgesamt wurde 1 ml jeder Fraktion gesammelt. Die Fraktionen 1–4 wurden kombiniert und unter Verwendung eines 100-kDa-MWCO-Filters auf 1 ml konzentriert und unter Verwendung von Größenausschluss (Superose 6) in 20 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 0,01 % Brij-35 und 5 mM TCEP aufgelöst. Insgesamt wurde 1 ml jeder Fraktion gesammelt. Auf der SDS-PAGE wurde bestätigt, dass es sich bei den Fraktionen 11–14 um reine ATR-ATRIP-Komplexe handelte.

SMG1-SMG9-Komplexe wurden wie zuvor beschrieben aus HEK293T-Zellen gereinigt70. RIPK1, RIPK2 und RIPK3 wurden wie zuvor beschrieben aus Insektenzellen (Sf9) gereinigt71. Die folgenden rekombinanten aktiven Kinasen wurden von anderen Labors bezogen. Rekombinante aktive CDK12-CycK-, CDK13-CycK- und CDK9-CycT-Komplexe wurden als Geschenke von M. Geyer bereitgestellt72,73. Rekombinantes aktives DCAMKL1/DCLK1 und MELK wurden als Geschenke von N. Gray, H.-T. bereitgestellt. Huang und K. Westover, Y. Liu und W. Harshburger74,75,76. Der rekombinante aktive Komplex PRPK (volle Länge) – CGI121/TPRKB (volle Länge) wurde als Geschenk von L. Wan und F. Sicheri bereitgestellt77. Rekombinanter aktiver HASPIN(452–798) wurde als Geschenk von A. Musacchio78 bereitgestellt. Rekombinantes aktives YSK1 wurde als Geschenk von X. Luo79 bereitgestellt. Rekombinantes CK1G2 wurde als Geschenk von S. Knapp zur Verfügung gestellt. Eine Liste der Katalog- und Chargennummern der gekauften rekombinanten Kinasen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Rekombinante Kinase wurde zu einer 384-Well-Platte gegeben, die Peptidsubstratbibliotheksmischungen in Lösungsphase bei 50 μM enthielt (Anaspec, AS-62017-1 und AS-62335). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μM ATP (50 μCi ml−1 γ-32P-ATP, Perkin-Elmer) gestartet und 90 Minuten lang inkubiert. Die Testbedingungen für jede Kinase sind in der Ergänzungstabelle 1 beschrieben (Ref. 80,81,82,83,84). Nach Abschluss der Reaktion wurden die Lösungen auf Streptavidin-konjugierte Membranen (Promega, V2861) getupft, wo die Peptide durch ihre C-terminale Biotinylierung eng miteinander verbunden waren. Die Membranen wurden gespült und dann mit dem Typhoon FLA 7000 Phosphorimager (GE) abgebildet, um das Ausmaß der Peptidphosphorylierung zu messen. Rohdaten (GEL-Datei) wurden mit ImageQuant (GE) quantifiziert, um Densitometriematrizen zu erstellen (Ergänzungstabelle 2). Für die Kinase ALPHAK3 wurden die Flecken aufgrund der räumlichen Variation des Hintergrundsignals auf den umgebenden Hintergrund normalisiert. PDHK1 und PDHK4 zeigten eine doppelte Spezifität für Serin und Tyrosin. Für diese Kinasen verwendeten wir eine maßgeschneiderte Peptidsubstratbibliothek ohne Tyrosinreste an zufällig ausgewählten Positionen.

Insgesamt wurden 283 menschliche Kinasemotive, ein Motiv aus einem Mauskinase-Ortholog (CDKL5), ein Motiv aus einem Rattenkinase-Ortholog (KIS) und ein Motiv aus einem Arthropoden Pediculus humanus corporis Kinase-Ortholog (PINK1) mit 17 menschlichen Kinasen kombiniert Motive, die wir zuvor veröffentlicht haben, einschließlich AKT185, SRPK135, SRPK235, SRPK335, CK1D35, DYRK1A86, DYRK286, GSK3A86, GSK3B86, CK1A86, CK1E86, CK1G186, CDK1087, CDK288, CDK388, CDK1888 und CDK7 89.

Für die Null-Kontroll-Experimente in Extended Data Abb. 6 wurden biotinylierte Peptide synthetisiert, die nur Serin oder Threonin als Phospho-Akzeptor enthielten, wobei alle neun umgebenden Positionen degenerierte Mischungen der 20 natürlichen Aminosäuren mit Ausnahme von Serin, Threonin, Tyrosin und Cystein enthielten .

Die Densitometriematrizen wurden an allen Positionen durch die Summe der 17 randomisierten Aminosäuren (ohne Serin, Threonin und Cystein) säulennormalisiert, um PSSMs zu ergeben (Ergänzungstabelle 2). PDHK1 und PDHK4 wurden auf die 16 randomisierten Aminosäuren (ausgenommen Serin, Threonin, Cystein und zusätzlich Tyrosin) normalisiert, was der einzigartig angepassten Peptidbibliothek entspricht, die diese Kinasen profiliert. Die Cysteinreihe wurde anhand ihres Medians auf 1/17 (1/16 für PDHK1 und PDHK4) skaliert. Die Serin- und Threoninwerte an jeder Position wurden auf den Medianwert dieser Position festgelegt. Das Verhältnis der Serin-zu-Threonin-Phosphoakzeptor-Günstigkeit (S0 bzw. T0) wurde durch Summieren der Werte der Serin- und Threonin-Reihen in der Densitometriematrix (SS bzw. ST) bestimmt, wobei die unterschiedliche Zusammensetzung von Serin gegenüber Threonin berücksichtigt wurde die zentralen (1:1) und peripheren (nur Serin oder nur Threonin) Positionen (Sctrl bzw. Tctrl) und dann auf den höheren Wert unter den beiden normalisieren (S0 bzw. T0, Ergänzende Anmerkung 1).

Das Dendrogramm in Abb. 2 wurde unter Verwendung der normalisierten Matrizen mit den 20 unmodifizierten Aminosäuren sowie Phosphothreonin und Phosphotyrosin erstellt. Die Verknüpfungsmatrix wurde mit dem SciPy-Paket in Python (v.3.7.6) und der Ward-Methode berechnet. Die Ergebnisse wurden in das Newick-Baumformat konvertiert und mit FigTree (v.1.4.4) dargestellt.

Zur Bewertung der Substrate wurden die Werte der entsprechenden Aminosäuren an den entsprechenden Positionen multipliziert und mit der Wahrscheinlichkeit eines zufälligen Peptids skaliert (Ergänzende Anmerkung 2).

Für den Perzentil-Score eines Substrats durch eine bestimmte Kinase haben wir zunächst die A-priori-Score-Verteilung dieses Kinase-PSSM berechnet, indem wir ein Referenz-Ser/Thr-Phosphoproteom mit 82.735 identifizierten Stellen4 unter Verwendung der oben diskutierten Methode bewertet haben (Abb. 3a). Der Perzentil-Score eines Kinase-Substrat-Paares ist definiert als die Perzentil-Rangfolge des Substrats innerhalb der Score-Verteilung jeder Kinase34. Dieser Wert wurde bei der Analyse aller erkannten Phosphorylierungsstellen zur Kinaseanreicherung verwendet.

Die einzelnen Phosphorylierungsstellen (ausgenommen mehrfach phosphorylierte Peptide) in den analysierten Phosphoproteomics-Studien wurden von allen charakterisierten Kinasen (303 Ser/Thr-Kinasen) bewertet, und ihre Ränge in der bekannten Phosphoproteom-Score-Verteilung wurden wie oben beschrieben bestimmt. Für jede nicht duplizierte, einfach phosphorylierte Stelle wurden Kinasen, die zu den Top-15-Kinasen für die Ser/Thr-Kinasen zählten, als biochemisch bevorzugte Kinasen für diese Phosphorylierungsstelle angesehen. Zur Beurteilung der Kinasemotivanreicherung in Phosphoproteomik-Datensätzen verglichen wir den Prozentsatz der Phosphorylierungsstellen, für die jede Kinase vorhergesagt wurde, unter den hochregulierten/herunterregulierten (erhöhten/verringerten) Phosphorylierungsstellen (Stellen mit |log2[facher Änderung]| gleich oder größer als der log[fold change]-Schwellenwert) im Vergleich zum Prozentsatz der biochemisch bevorzugten Phosphorylierungsstellen für diese Kinase innerhalb des Satzes unregulierter (unveränderter) Stellen in dieser Studie (Stellen mit |log2[fold change]| weniger als dem log[fold change] Schwelle). Der logarithmisch transformierte Faltungsänderungsschwellenwert wurde für alle Panels in Abb. 4 auf 1,5 festgelegt, mit Ausnahme von Abb. 4e, in der der Schwellenwert aufgrund des geringen Bereichs des Logarithmus [Faltungsänderung] in den Daten auf 0,5 festgelegt wurde. Kontingenztabellen wurden mithilfe der Haldane-Korrektur korrigiert (Hinzufügen von 0,5 zu den Fällen mit Null in einer der Zählungen). Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der einseitigen exakten Fisher-Tests bestimmt und die entsprechenden P-Werte wurden mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens angepasst. Kinasen, die sowohl für die hochregulierte als auch für die herunterregulierte Analyse signifikant angereichert (angepasstes P ≤ 0,1) oder abgereichert (log2[Frequenzfaktor] < 0) waren, wurden von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen. Dann wurde für jede Kinase die signifikanteste Anreicherungsseite (hochreguliert oder herunterreguliert) auf der Grundlage des angepassten P-Werts ausgewählt und in den Vulkandiagrammen dargestellt.

Sequenzlogos wurden mit dem Logomaker-Paket in Python90 erstellt. Für einzelne Kinasen wurde die normalisierte Matrix verwendet, wobei die Höhe jedes Buchstabens das Verhältnis seines Wertes zum Medianwert dieser Position ist. Die Serin- und Threonin-Höhen in der Mittelposition (Position Null) wurden auf das Verhältnis ihrer Günstigkeit eingestellt. Für geclusterte Kinasengruppen wurde die durchschnittliche Matrix berechnet und wie oben beschrieben als Sequenzlogo dargestellt.

Für Extended Data Abb. 7 wurden Kinasen nach ihren log2[S0/T0]-Werten sortiert. Für das Sequenzlogo wurden Kinasedomänen von 290 verfügbaren Kinasen aus zuvor abgeglichenen Kinasesequenzen erhalten91. Die Alignments zu den Resten Met1–Leu296 in CDK2 (Proteindatenbank (PDB): 1QMZ) wurden für jede Kinase erhalten, und die Häufigkeiten von Aminosäuren in Schritten von 15 Kinasen wurden berechnet und als Sequenzlogo aufgetragen.

Experimentell validierte Kinase-Substrat-Beziehungen wurden von PhosphoSitePlus (Juli 2021) erhalten. Die Anzahl der Berichte für jedes Paar wurde durch die Summe der In-vivo- und In-vitro-Berichte bestimmt.

Experimentelle Schemata und veranschaulichende Modelle wurden mit BioRender (https://biorender.com/) erstellt. Kinome-Baumbilder wurden mit Coral (http://phanstiel-lab.med.unc.edu/CORAL/) erstellt und modifiziert. Strukturelle Darstellungen wurden mit PyMOL erstellt. Generische Kinasedomänen in Abb. 1 und 3 waren wie folgt: PKAα (PDB: 1ATP). Die Kinase- und Substratstrukturen in Abb. 3 waren wie folgt: ATM (PDB: 7SIC)92 und p53 (Chimäre von AlphaFold AF-P04637-F1-model_v2_1 (1–95)61 und 2ATA(96–292)92) (Abb . 3c) und PHKG2 (PDB: 2Y7J)92 und PYGM (PDB: 1ABB)92 (Abb. 3b).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten (RAW-Dateien) und analysierten Daten werden in diesem Dokument bereitgestellt. Alle in dieser Studie erzeugten Plasmide wurden entweder bei Addgene hinterlegt oder sind auf Anfrage erhältlich.

Die in dieser Studie verwendeten Analysetools und der zugrunde liegende Code stehen der Öffentlichkeit online zur Verfügung (https://kinase-library.phosphosite.org).

In der ursprünglich mit diesem Artikel veröffentlichten Version der Ergänzungstabelle 2 wurden die Daten auf dem Blatt „ser_thr_all_raw_matrices“ fälschlicherweise nach Spalten statt nach Zeilen angeordnet und sind nun in der überarbeiteten Ergänzungstabelle 2, die diesem Artikel beiliegt, korrekt umgesetzt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken M. Begley und T. DeFalco für hilfreiche Diskussionen und technische Unterstützung; und T. Levy, S. Beausoleil, L. D'Amato, P. Lobo, M. Tran und C. Valencia für technische Unterstützung. TMY dankt S. Yaron, N. Yaron, JR Haddad und S. Haddad für ihre Unterstützung; und JLJ dankt M. Bak-Johnson für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde durch den FELLOW Award der Leukemia & Lymphoma Society (an JLJ und LCC) unterstützt; Das National Institute of Health gewährt P01 CA120964 (an LCC), R35-CA197588 (an LCC), P01-CA117969 (an LCC), R35-ES028374 (an MBY), R01-CA226898 (an MBY), R01-GM104047 (an BET). und MBY), U24 DK116204 (zu BET und LCC) und R35-GM139550 (zu DJT); der gemeinsam von Cancer Research UK und Brain Tumor Charity finanzierte Brain Tumor Award C42454/A28596 (an MBY); die Charles and Marjorie Holloway Foundation (an MBY); und das MIT Center for Precision Cancer Medicine. Unterstützung kam auch durch die Cancer Center Support Grants P30-CA14051 und T32CA203702 (an ERK) des National Cancer Institute.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jared L. Johnson, Tomer M. Yaron

Meyer Cancer Center, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Jared L. Johnson, Tomer M. Yaron, Emily M. Huntsman, Alexander Kerelsky, Junho Song, Amit Regev, Ting-Yu Lin, Katarina Liberatore, Daniel M. Cizin, Benjamin M. Cohen, Yilun Ma, Edward R. Kastenhuber, Marcus D. Goncalves, John Blenis und Lewis C. Cantley

Medizinische Fakultät, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Englander Institute for Precision Medicine, Institut für Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Tomer M. Yaron, Alexander Kerelsky und Olivier Elemento

Abteilung für Physiologie und Biophysik, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Tomer M. Yaron & Olivier Elemento

Tri-institutionelles PhD-Programm in Computational Biology & Medicine, Weill Cornell Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center und The Rockefeller University, New York, NY, USA

Tomer M. Yaron

Weill Cornell Graduate School of Medical Sciences, Programm für Zell- und Entwicklungsbiologie, New York, NY, USA

Ting-Yu Lin

Medizinische Fakultät, Abteilung für Hämatologie/Onkologie, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Neil Vasan

Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Neil Vasan

Labor für Informatik und künstliche Intelligenz, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Konstantin Krismer

Zentrum für Präzisionskrebsmedizin, Koch-Institut für Integrative Krebsbiologie, Abteilungen für Biologie und Biotechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Konstantin Krismer, Bert van de Kooij, Anne E. van Vlimmeren und Michael B. Yaffe

Abteilung für Pharmakologie, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA

Jaylissa Torres Robles & Benjamin E. Turk

Fakultät für Chemie, Yale University, New Haven, CT, USA

Jaylissa Torres Robles

Institute of Genetics, Technische Universität Braunschweig, Braunschweig, Germany

Nicole Andrée-Busch & Norbert F. Käufer

Abteilung für Pharmakologie, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ, USA

Maxim V. Dorovkov und Alexey G. Ryazanov

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN, USA

Yuichiro Takagi

Abteilung für Endokrinologie, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Marcus D. Goncalves

Abteilung für Genetik und Genomwissenschaften, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Benjamin D. Hopkins

Abteilung für Biochemie, University of Colorado, Boulder, CO, USA

Dylan J. Taatjes

SABNP, Universität Evry, INSERM U1204, Universität Paris-Saclay, Evry, Frankreich

Alexander Maucuer

Abteilung für Investigative Medizin, Graduate School of Medicine, Universität Ryūkyū, Nishihara-cho, Japan

Akio Yamashita

Abteilung für Entwicklungs-, Molekular- und Chemische Biologie, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA

Alexei Degterev

Abteilung für Bioinformatik, Zellsignaltechnologie, Danvers, MA, USA

http://dx.doi.org/10.1037/0021-843X.112.2.202 Sean D. Landry, Bin Zhang, Ian Cossentino und Peter V. Hornbeck

Rewire Tx, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Rune Linding

Abteilung für Pharmakologie, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

John Blenis

Abteilung für Biochemie, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

John Blenis

Abteilungen für Akutchirurgie, Trauma und chirurgische Intensivpflege sowie chirurgische Onkologie, Abteilung für Chirurgie, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Michael B. Yaffe

Programm für chirurgische Onkologie, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Michael B. Yaffe

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JLJ, TMY, LCC, MBY und BET haben das Projekt konzipiert, Experimente entworfen und die Daten analysiert. JLJ und TMY generierten Zahlen. JLJ führte die PSPA-Experimente durch. TMY leitete die rechnerischen Analysen. TMY, EMH, AK, DMC, BMC, KK, MU, JL, SDL, BZ und IC führten rechnerische Analysen durch. JLJ, JS, AR, T.-YL, NV, KL, YM, AD, AY und AM erzeugten rekombinante Proteine. JLJ, TMY, BET, JTR, MBY und LCC führten Strukturmodellierungen durch. PVH, DJT, YT, NA-B., NFK, BvdK, AEvV, MVD, AGR, ERK, MDG, BDH, OE, RL und JB haben Daten beigesteuert und an Diskussionen teilgenommen. JLJ, TMY, MBY, BET und LCC haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren geschrieben und bearbeitet.

Korrespondenz mit Benjamin E. Turk, Michael B. Yaffe oder Lewis C. Cantley.

LCC ist Gründer und Vorstandsmitglied von Agios Pharmaceuticals und ist Gründer und erhält Forschungsunterstützung von Petra Pharmaceuticals; ist als Erfinder eines Patents (WO2019232403A1, Weill Cornell Medicine) für eine Kombinationstherapie für PI3K-assoziierte Krankheiten oder Störungen und die Identifizierung therapeutischer Interventionen zur Verbesserung der Reaktion auf PI3K-Inhibitoren zur Krebsbehandlung aufgeführt; ist Mitbegründer und Anteilseigner von Faeth Therapeutics; ist an Cell Signaling Technologies, Volastra, Larkspur und 1 Base Pharmaceuticals beteiligt und berät diese Unternehmen; und berät für Loxo-Lilly. MBY erhält Forschungsunterstützung von Cardiff Oncology. TMY ist Mitbegründer und Aktionär sowie Mitglied des Vorstands von DESTROKE, einem Start-up-Unternehmen im Frühstadium, das mobile Technologie für die automatisierte klinische Schlaganfallerkennung entwickelt. JLJ hat Beratungshonorare von Scorpion Therapeutics und Volastra Therapeutics erhalten. OE ist Gründer und Anteilseigner von Volastra Therapeutics und OneThree Biotech; ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Owkin, Freenome, Genetic Intelligence, Acuamark und Champions Oncology; und erhält Forschungsunterstützung von Eli Lilly, Janssen und Sanofi. DJT ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Dewpoint Therapeutics. AD ist Anteilseigner von Denali Therapeutics; und erhält Forschungsunterstützung von Interline Therapeutics. NV berichtet über Beratungstätigkeiten für Novartis und ist im wissenschaftlichen Beirat von Heligenics. MDG ist Mitbegründer und Anteilseigner von Faeth Therapeutics, das diätetische und pharmakologische Therapien gegen Krebs entwickelt; und hat Vortrags- und/oder Beratungshonorare von Pfizer, Novartis, Scorpion Therapeutics und Faeth Therapeutics erhalten.

Nature dankt Tony Hunter und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Venn-Diagrammdarstellung der Prozentsätze von drei prominenten Ser/Thr-Kinase-Motivmerkmalen, die zu den Clustern 1, 2 und 3 in Abb. 2 gehören, an 82.735 menschlichen Serin- und Threonin-Phosphorylierungsstellen, die in Massenspektrometrieexperimenten zuverlässig identifiziert wurden4. Die phosphorylierten Reste in den Logos werden als S/T dargestellt.

Unterkategorisierung von Cluster 1 aus Abb. 2 in 11 Motivklassen.

Unterkategorisierung von Cluster 2 aus Abb. 2 in 5 Motivklassen.

Unterkategorisierung von Cluster 3 aus Abb. 2 in 8 Motivklassen.

a, Synthetisches Peptid aus seinem Komplex mit PAK4 (PDB: 2Q0N), modelliert nach WNK3 (PDB: 5O26). Der gepunktete Kreis markiert eine flache hydrophobe Tasche, die einen +3 Phe-Rest beherbergt. b, GSK3-Peptid aus seinem Komplex mit AKT2 (PDB: 1O6L), modelliert nach CAMKK2 (PDB: 2ZV2). Der Kreis zeigt eine hydrophobe Tasche an, die einen −2-aliphatischen Rest aufnehmen könnte. c, Monophosphoryliertes Peptid aus p63, gebunden an CK1δ (PDB: 6RU6), modelliert nach GRK2 (PDB: 1YM7). Der Kreis zeigt ein positives Oberflächenpotential in der Nähe der −2- und −3-pSer-Reste. d, an CK1δ (PDB: 6RU8) gebundenes p63-Peptid wurde auf YANK1 (PDB: 4FR4) modelliert und zeigte potenzielle Bindungsstellen für −3 und +2 phosphorylierte Reste. Die Oberflächenelektrostatik wird mit Coulomb-Potenzialwerten dargestellt, die in ChimeraX berechnet und durch Maßstabsbalken (kcal/mol·e) dargestellt werden.

a, In-vitro-Phosphorylierungstests mit rekombinanten Kinasen und Substratpeptiden, die entweder Serin- oder Threonin-Phospho-Akzeptoren enthalten. Ergebnisse für 208 rekombinante Ser/Thr-Kinasen angezeigt. b, Korrelationsdiagramm der experimentellen Ergebnisse in (a) mit dem Positionssummenansatz, der in dieser Studie angewendet wurde, um die Ser/Thr-Phospho-Akzeptor-Präferenz zu bewerten.

a, unten, relative Präferenzen für Ser- oder Thr-Phospho-Akzeptorreste für jede Kinase, geordnet in der Reihenfolge abnehmender Ser/Thr-Selektivität. Oben: Häufigkeit von Aminosäuren an den DGF+1-Positionen der entsprechenden Kinasen (Bin-Größe: 15 Kinasen). b, Strukturelle Darstellung der Nähe zwischen dem DFG+1-Rest und dem Substrat-Phospho-Akzeptor-Rest, gezeigt mit der AKT1-Kinasedomäne gebunden an das Substratpeptid (GSK3β) (pdb 1O6K).

a, Perzentil-Score-Verteilungen von Substraten für ihre in der Literatur kommentierten Kinasen (AUCDF = Fläche unter der kumulativen Verteilungsfunktion). b, Perzentil-Score der in der Literatur kommentierten Kinase-Substrat-Paare als Funktion der Anzahl der Berichte. Eine höhere Anzahl von Berichten korreliert mit günstigeren Perzentilwerten zwischen der gemeldeten Kinase und ihrem Substrat. n = 9.073, n = 3.945, n = 544, n = 224 und n = 201 für Kinase-Substrat-Beziehungen mit 1, 2, 3, 4 bzw. 5 oder mehr Berichten. Statistische Analysen wurden mit dem doppelseitigen Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Box-Minima = 25. Perzentil, Mitte = 50. Perzentil, Maxima = 75. Perzentil. Whisker erstrecken sich von den Maxima oder Minima der Box bis zum größten oder kleinsten Wert, nicht weiter als 1,5 x Interquartilabstand. (ns p > 0,05, * p ≤ 0,05, ** p ≤ 10−3, *** p ≤ 10−4, **** p ≤ 10−5).

a, Rangverteilungen von Kinasen für ihre in der Literatur kommentierten Substrate (AUCDF = Fläche unter der kumulativen Verteilungsfunktion). b: Rang der in der Literatur kommentierten Kinase-Substrat-Paare als Funktion der Anzahl der Berichte. Eine höhere Anzahl von Berichten korreliert mit einem günstigeren Ranking der gemeldeten Kinase für ihr Substrat. n = 9.073, n = 3.945, n = 544, n = 224 und n = 201 für Kinase-Substrat-Beziehungen mit 1, 2, 3, 4 bzw. 5 oder mehr Berichten. Statistische Analysen wurden mit dem doppelseitigen Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Box-Minima = 25. Perzentil, Mitte = 50. Perzentil, Maxima = 75. Perzentil. Whisker erstrecken sich von den Maxima oder Minima der Box bis zum größten oder kleinsten Wert, nicht weiter als 1,5 x Interquartilabstand. (ns p > 0,05, * p ≤ 0,05, ** p ≤ 10−3, *** p ≤ 10−4, **** p ≤ 10−5).

a, Darstellung der mitochondrial lokalisierten Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes durch Phosphorylierung durch die PDHKs. Bewertungsergebnisse für PDHA1 Ser293, wobei die Kinasen der PDHK-Familie hervorgehoben werden. b, Illustration der dockinggesteuerten Phosphorylierung von ERK1/2 durch MEK1/2. Bewertungsergebnisse für ERK1 Thr202 / ERK2 Thr203 (identische Sequenzen), wobei MEK1 und MEK2 hervorgehoben werden.

Darstellung der Phosphorregulation von RNA-Polymerase II (POLR2A) CTD und Retinoblastoma-Protein (Rb) durch ihre jeweiligen kanonischen CDKs, die Transkriptions-CDKs (lila) und die Zellzyklus-Progressions-CDKs (grün) (links). Verbindungen zwischen Kinasen und Substraten entsprechen günstigen Werten zwischen Motiven und Phosphorylierungsstellen (rechts).

Ergänzende Abbildungen. 1 und 2 und Ergänzende Anmerkungen 1 und 2.

Profilierung der Ser/Thr-Kinase-Substratspezifität. Experimentelle Details zur Gewinnung und Profilierung der rekombinanten Ser/Thr-Kinasen in dieser Studie.

PSPA-Daten und PSSMs. Aus PSPA-Experimenten erhaltene Rohdensitometrien und ihre normalisierten Formen.

Annotation des menschlichen Ser/Thr-Phosphoproteoms. Insgesamt 89.752 experimentell identifizierte Ser- und Thr-Phosphorylierungsstellen wurden von 303 Ser/Thr-Kinase-PSSMs bewertet. Die Tabelle ermöglicht es, Substrate nach Perzentilwerten oder Rängen für bestimmte Kinasen oder nach Promiskuitätsindizes (die Anzahl der Kinasen, die über dem 90. Perzentil liegen) oder mittleren Perzentilwerten zu sortieren (Abb. 3d).

Motivanreicherungsanalyse mit ATM. Die Serin- und Threonin-Phosphorylierungsstellen wurden nach der Behandlung mit ionisierender Strahlung hochreguliert (Abb. 4e), wobei ATM zu den Top 15 von 303 vorhergesagten Kinasen zählte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Johnson, JL, Yaron, TM, Huntsman, EM et al. Ein Atlas der Substratspezifitäten für das menschliche Serin/Threonin-Kinom. Natur 613, 759–766 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05575-3

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Eingegangen: 01. Mai 2022

Angenommen: 17. November 2022

Veröffentlicht: 11. Januar 2023

Ausgabedatum: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05575-3

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